EZH2基因3'非翻译区慢病毒载体构建及重组体筛选

赵卫卫，彭 攸，李晓娇，卢晓佳，王玉平，刘萃萃，王璐璐，冯 景

(南方医科大学附属奉贤医院检验科，上海201400)

EZH2基因是人们新近认识的一种人类基因，定位于染色体7q35，是一种转录阻遏因子，可抑制抑癌基因的活性，具有促进多种肿瘤的转移特征［1-2］。大量研究表明，乳腺癌发生、发展与EZH2基因密切相关［3-6］。进一步研究表明，miRNAs对 EZH2的表达有重要的调控作用［7-8］。miRNA是一种不编码蛋白的单链小分子RNA，其通过完全或不完全地与靶mRNA的3'UTR互补结合，引起靶基因的翻译抑制或切割降解，从而调控基因的表达［9］。本研究尝试将 EZH2基因3'UTR序列定向克隆到慢病毒筛选载体上，构建携带EZH2基因3'UTR的慢病毒筛选载体，在包装质粒的辅助作用下包装成慢病毒颗粒，并转染乳腺癌细胞株MCF-7，获得稳定表达EZH2 3'UTR的细胞株，为后续的筛选miRNAs奠定基础。

材料和方法

一、材料

293T细胞株、乳腺癌细胞株MCF-7(上海中科院提供);pMD19-T载体(TaKaRa公司);CTX靶点筛选系统慢病毒表达载体及包装质粒(SBI公司);Taq DNA聚合酶、4×dNTP(Promega公司);DNA连接酶、限制性内切酶BamHI和EcoR I(TaKaRa公司);RNA提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒(QIAGEN公司);Lipofecter脂质体转染试剂(碧云天公司);Marker-DL2000、低熔点琼脂糖(上海生物工程公司)。

二、方法

1.EZH2 3'UTR重组筛选载体的构建 查询PubMed数据库(www.PubMed.com)查找人EZH2 mRNA序列，根据EZH2 3'UTR序列信息设计引物。引物序列 上游P5:5'-CT(保护碱基)GGATCC(划线部分为BamHI酶切位点)CATCTGCTACCTCCTCC-3'，下游P3:5'-CA(保护碱基)GAATTC(划线部分为 EcoRI酶切位点)GATTCAACAAGGACAAGTT-3'。抽提乳腺癌组织总RNA，进行逆转录PCR反应。反应条件为94℃预变性3 min，94℃变性30 s，55℃复性 30 s，72℃延伸30 s，共35个循环。对CTX-Lentivirus空质粒和pMD19T-EZH2 3'UTR重组质粒分别用BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切，酶切产物在T4DNA连接酶作用下与16℃连接1h。转化感受态大肠杆菌，次日挑取菌落进行PCR，对于阳性菌落进行抽取质粒，以BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切进行重组质粒鉴定后送于上海生工生物工程公司进行测序。

2.病毒颗粒的包装和生产 将对数生长期的293T细胞进行胰酶消化后，接种到6孔板中。用脂质体法将病毒包装 pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV、pVSV-G三质粒混合物(500 ng/μL)7.5μL 和 CTX-EZH2'UTR 慢病毒质粒(609 ng/μL)1.2μL共转染 293T 细胞，混匀后放回到5%CO2培养箱中。6h后，移去细胞上清，更换为5mL的DMEM完全培养基。收集转染72 h后的293T细胞上清，用Real-Time PCR对病毒进行滴度测定。CMV上游引物P5:5'-ACGTATTGTCATC-GCTATTACCAT-3'，CMV下游引物 P3:5'-TGGAAATCCCCGTGAGTCAAA-3'，CMV 探针:5'CGCTATCCACGCCCATTGATGTACTGCC-3'。以CMV上下游引物，以 tubulin为内参进行定量PCR，检测病毒滴度。

3.重组慢病毒感染MCF-7细胞阳性细胞株的筛选 将细胞接种于6孔板中，择合适的感染复数(MOI)值，加入适量的病毒，同时加入终浓度为10 μg/mL的 polybrene增强病毒感染。感染24h后换成无病毒和polybrene的完全培养基继续培养。在感染前进行预实验，摸索最佳筛选药物浓度。感染72 h后收集细胞，将其置于含嘌呤霉素的完全培养基中筛选，并进行克隆和扩增。

4.PCR鉴定重组体在MCF-7细胞中的整合收集经嘌呤霉素筛选的阳性细胞，提取基因组DNA。根据慢病毒载体上CMV启动子的序列设计引物，阳性细胞的基因组DNA为模板，进行PCR反应。反应体系:94℃预变性3 min，94℃变性30 s，60℃复性30 s，72℃延伸30 s，共33个循环。通过PCR鉴定EZH2 3'UTR与MCF-7细胞基因组整合量。

5.Western blotting检测慢病毒感染乳腺细胞株MCF-7后EZH2蛋白表达 以未感染EZH2 3'UTR的MCF-7乳腺癌细胞为对照组，细胞培养后，分别收获实验组和对照组细胞，加入组织细胞裂解液提取蛋白，配制10%的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶，上样量为20 μL，进行电泳。恒压80V至分离胶处后100V至电泳结束。200mA，1 h将蛋白电转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜，转膜结束后EZH2用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1 h，4℃封闭过夜。EZH2一抗工作浓度为1∶300，4℃过夜，actin一抗工作浓度为1∶200，室温3h。TBST洗膜10 min×3次;加入二抗，工作浓度为1∶300，室温反应2 h 30 min，TBST洗膜10 min×3次。加入化学发光底物，暗室压片，曝光后显影、定影。

三、统计学方法

结 果

一、目的片段EZH2 3'UTR的获取

经PCR扩增后，用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行产物鉴定，目的片段大小为275bp，与预期扩增的基因片段大小一致，见图1。

图1 目的片段EZH2 3'UTR凝胶电泳结果

二、克隆载体pMD19-T-EZH2 3'UTR的构建及鉴定

目的片段EZH2 3'UTR与克隆载体pMD19-T通过连接酶连接后，转化大肠杆菌后，次日随机挑取6个菌落进行PCR鉴定，可见除1个克隆未出现目的条带外，其余5个均出现目的条带，大小为275bp，与预期片段大小相符，见图2。BamHⅠ、EcoRⅠ双切酶克隆载体pMD19-T—EZH2 3'UTR后，在电泳下可见275bp处有目的条带，与预期片段大小相符，见图3。

图2 pMD19-I-EZH2 3'UTR菌落PCR扩增结果

图3 pMD19-T-EZH2 3'UTR双酶切鉴定

三、重组慢病毒筛选载体 CTX-Lentivirus-EZH2 3'UTR构建及鉴定

从AMP+的LB平板上随机挑克隆，进行菌落PCR鉴定，对于阳性重组子用BamHⅠ、EcoRⅠ进行双酶切鉴定，在约10.2Kb处可见线性慢病毒质粒和275bp的目的条带，见图4，测序结果显示目的片段已经克隆到慢病毒载体中。

图4 CTX-Lentivirus-EZH2 3'UTR双酶切鉴定

四、重组慢病毒颗粒滴度测定

对病毒进行裂解后用裂解的病毒上清作为模板，以CMV的上下游P3、P5为引物，进行实时定量PCR，做复管得到CMV1和CMV2的值为1.6×107拷贝/mL和2.1×107拷贝/mL，通过病毒滴度计算公式得到:病毒滴度为4.3×109拷贝/mL。

五、重组慢病毒感染乳腺癌MCF-7细胞株后整合量的鉴定

经梯度摸索筛选稳定整合MCF-7细胞的最佳浓度为0.2μg/mL。经Real-Time PCR检测，实验组病毒整合入细胞基因组的值与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。表明重组EZH2 3'UTR慢病毒载体在MCF-7细胞中很好地与细胞基因组整合，见图5。

图5 MCF-7细胞中重组慢病毒载体的整合量鉴定

六、Western blotting检测乳腺癌细胞MCF-7中EZH2蛋白表达

Western blotting检测显示，在EZH2慢病毒感染实验组中，EZH2蛋白呈高表达，而没有感染EZH2 3'UTR的MCF-7乳腺癌细胞对照组，则少量表达EZH2蛋白，见图6。

图6 转染慢病毒后EZH2蛋白的表达

讨 论

近年研究发现表观遗传调控因子PcG蛋白(polycomb group proteins)在乳腺癌的发生、发展过程中起重要作用［10］，其核心成分EZH2蛋白广泛受到人们关注。EZH2通过催化组蛋白H3氨基末端的第27位赖氨酸(H3K27)发生三甲基化［11］，促进或维持染色体的转录抑制状态，从而沉默癌组织中的抑癌基因的表达［12］。Raaphorst等［13］研究发现，在浸润性导管癌EZH2表达明显增加，表明EZH2是肿瘤发生发展的早期阶段的分子事件，直接参与了乳腺癌的演变过程。EZH2高表达机制尚不清楚，但大量研究表明miRNAs对EZH2的表达有重要的调控作用［7-8］。miRNAs可通过与EZH2基因的3'端非翻译区形成碱基配对抑制其表达。构建3'非翻译区慢病毒筛选载体为深入了解EZH2与miRNAs相互的关系显得非常必要。

慢病毒载体是以人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)来源的一种病毒载体［14-15］，与腺病毒相比，其具有可感染分裂细胞及非分裂细胞，转移片段容量较大，目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点［15-16］。本实验所选择的是长末端重复序列(LTR)缺失的慢病毒载体，经该载体包装产生的病毒颗粒属于假型病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒［17］。利用成功构建的EZH2基因3'非翻译区慢病毒筛选载体，将目的片段EZH2基因3'非翻译区整合到MCF-7的基因组中，经Real-Time PCR检测证实，目的片段在乳腺癌MCF-7中稳定整合。同时Western blotting检测显示，在EZH2慢病毒感染实验组中，EZH2蛋白呈高表达，而没有感染EZH2 3'UTR的空MCF-7细胞对照组，则低量表达EZH2蛋白，且该结果与Kleer等［18］的研究结果基本一致。

本研究成功构建人EZH2基因3'非翻译区慢病毒筛选载体，并感染乳腺癌细胞MCF-7，使其在乳腺细胞中稳定整合，为miRNAs筛选提供理想的病毒载体，同时该慢病毒载体带有荧光报告系统，通过荧光报告基因分析，可以很好实现miRNAs与EZH2基因的3'端非翻译区的功能验证。

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