丹参酮ⅡA与丹皮酚配伍对大鼠脑缺血的保护作用

张涓，张恩户 （陕西中医学院药理教研室，陕西 咸阳712046）

双丹方由丹参、牡丹皮2味药组成，该药对出自《施今墨对药》，属于清热活血药对中的相须配伍。目前市面上常见该方的制剂有双丹胶囊、双丹颗粒、双丹口服液等。双丹口服液为中国药典2005年版新增品种，主治气虚血淤之胸痹心痛（缺血性心脏病）。此类复方制剂均以丹参的水溶性成分为质控指标。现代医学证明，缺血性心脑血管病的发病机制基本相似，因而治疗上大部分相似。研究发现，丹参、牡丹皮脂溶性的有效成分丹参酮ⅡA配伍丹皮酚对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用［1］，丹参酮ⅡA与丹皮酚仅分别按（1∶2）、（1∶3）、（1∶4）比例配制。试验以基线等比增减设计法配制丹参酮ⅡA和丹皮酚的不同配比，研究其配伍组合对大鼠脑缺血保护作用的影响。有效成分组方可提高双丹方的临床疗效，为防治脑血管病的中药新药二次开发提供参考依据。

1 材料与方法

1．1 药品与试剂 丹参酮ⅡA（西安鸿生生物技术有限公司，含量≥98%，批号120306）；丹皮酚（陕西天之润生物科技有限公司，含量≥99．1%，批号TZR－111019）；根据文献［1－2］和我们的预试验，按基线等比增减设计法，将丹参酮ⅡA与丹皮酚在总量（200 mg·kg－1）恒定的前提下，以中国药典、文献等设计配比基线，在基线基础上丹参酮ⅡA以一定梯度递减，而丹皮酚以相同梯度递增，分别递增递减到两侧极点，共配制5个不同比例的配合物，丹参酮ⅡA与丹皮酚比例分别为4∶0、3∶1、2∶2、1∶3和0∶4；双丹胶囊（广州莱泰制药有限公司，批号110701）；尼莫地平（亚宝药业集团股份有限公司，批号091007）；上述所有药品均用0．05%聚山梨酯80的纯化水配成混悬液，超声溶解备用；2，3，5－三苯基氯化四氮唑（TTC，国药集团化学试剂有限公司）；水合氯醛（上海市山浦化工有限公司，批号21100104）。

1．2 动物 SD大鼠，雄性，SPF级，体质量（350±30）g，西安交通大学医学院实验动物中心，动物许可证号：SCXK （陕）2007－001。

1．3 分组、给药与模型复制 取SD大鼠100只，按体质量均衡随机分为9组，即假手术组、模型组、尼莫地平组（30 mg·kg－1）、双丹胶囊组（1 g·kg－1）和丹参酮ⅡA与丹皮酚各配伍组（200 mg·kg－1）。各组每天均按10 mL·kg－1、ig给药一次，连续给药7 d［3］。末次给药后2 h，除假手术组外，其余各组动物按改良线栓法［4］采用10%水合氯醛（3．5 mL·kg－1）ip麻醉，固定，颈部开口暴露右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，结扎颈外动脉根部和颈总动脉近心端，微动脉夹暂时夹闭颈总动脉远心端，在颈总动脉结扎的上端距离颈总动脉分叉处剪一小口，将提前处理好的蘸有石蜡的的渔线（直径0．28 mm）沿切口插入，置入颈内动脉约17～18 mm，出现轻微阻力感为止，即到达大脑中动脉起始部，结扎颈总动脉固定栓线，并记录时间，剪去剩余部分。假手术组仅进行麻醉和血管分离，其余各组手术步骤按上述方法进行。

1．4 神经功能评分 造模后的6、24、48 h，根据Zea－Longa5级评分标准进行大鼠神经功能障碍评分［5］：0分，活动正常；1分，不能完全伸展左前肢；2分，行走时向左侧旋转；3分，行走时向左侧倾倒；4分，不能自行行走。以1～3分为有效模型，0分及昏迷不醒者剔除。

1．5 脑梗死体积及脑含水量 处死大鼠，取脑，置－20℃ 冰箱冷冻后，将大脑冠状切成6片，置2%TTC溶液中，37℃水浴避光孵育30 min，10%甲醛溶液固定24 h，经染色后非缺血区为玫瑰红色，梗死区为白色。将白色组织仔细挖下称重，以梗死组织质量占全脑质量的百分比作为脑梗死体积［6］。另取脑迅速称湿重后，放入烘箱中105℃烘至恒重后，取出，称干重，脑含水量＝（湿重－干重）／湿重×100%。

2 结果

2．1 对神经功能评分的影响 结果见表1。

表1 各组大鼠不同时间点神经功能评分的比较（±s）Tab 1 Comparison of neurological deficit scores at different time points in each group rats（±s）

表1 各组大鼠不同时间点神经功能评分的比较（±s）Tab 1 Comparison of neurological deficit scores at different time points in each group rats（±s）

注：与模型组比较，aP＜0．05，b P＜0．01

组别 n 6 h评分 n 24 h评分 n 48 h 评分假手术组9－9－9－模型组 11 3．00±0．71 9 1．80±0．84 8 1．80±0．84尼莫地平 10 2．25±0．50 8 1．50±1．00 7 1．50±0．58双丹胶囊 10 1．75±0．50 9 1．25±0．96 8 1．25±0．50丹参酮IIA 9 2．25±0．96 8 1．75±0．96 8 1．00±0．82配伍（3∶1） 9 2．00±1．00 8 2．00±1．00 8 1．33±0．58配伍（2∶2） 10 1．75±0．96a7 1．75±0．50 7 1．50±1．00配伍（1∶3） 9 1．25±0．50b 8 1．00±0．82 8 1．00±0．82丹皮酚 10 2．00±0．82 9 2．00±0．82 8 1．25±0．50

由表1可见，假手术组大鼠没有神经功能缺损表现，其余组大鼠缺血6 h出现了不同程度的神经功能缺损症状，24、48 h有所减轻。表现为左侧前爪不能完全伸展，行走时向左侧旋转或倾倒，甚至不能行走，不同时间点大鼠有死亡。各给药组可不同程度改善损伤模型大鼠6、24、48 h的神经缺损症状。造模后6 h，配伍（2∶2）、（1∶3）组与模型组比较有统计学差异（P＜0．05或P＜0．01）。

2．2 对脑梗死体积及脑含水量的影响 结果表明，与假手术组比较，模型组的脑梗死体积、脑含水量有统计学差异（P＜0．01或P＜0．05）。与模型组比较，配伍（1∶3）组的脑梗死体积及脑含水量有统计学差异（P＜0．05），见图1，表2。

图1 大鼠脑缺血48 h TTC染色图Fig 1 Cerebral infarct detecting with TTC staining method after 48 h in cerebral ischemia rats

表2 各组大鼠脑梗死体积和脑含水量的比较（±s）Tab 2 Comparison of percent of cerebral infarct volume and water content in each group rats（±s）

表2 各组大鼠脑梗死体积和脑含水量的比较（±s）Tab 2 Comparison of percent of cerebral infarct volume and water content in each group rats（±s）

注：与模型组比较，aP＜0．05，b P＜0．01

组别 n 脑梗死体积／% 脑含水量／%假手术组 9 0．0±0．0b 72．9±2．8a模型组 8 28．2±8．0 76．3±1．8尼莫地平 7 24．8±9．8 75．1±1．9双丹胶囊 8 20．2±7．9 74．9±1．7丹参酮IIA 8 19．3±11．1 75．7±1．6配伍（3∶1） 8 18．8±2．8 78．2±3．8配伍（2∶2） 7 17．3±7．6 73．3±2．6配伍（1∶3） 8 9．6±4．6a 72．8±2．3a丹皮酚 8 18．2±5．4 73．3±1．6

3 讨论

本试验采用基线等比增减设计法，在药物总浓度相等的前提下，参考传统中药复方理论和依据现实应用基础设计配比基线，这种方法尤其适用于那些药效基础和效应相对明确，药味较少的复方［7］。丹参的活性成分主要分为脂溶性和水溶性两类。丹参酮ⅡA是丹参脂溶性成分的代表物质，丹皮酚是牡丹皮的主要有效成分。由于丹参酮ⅡA和丹皮酚均属于脂溶性成分，易穿过血脑屏障，活血化淤，从而可改善脑部血液循环，防止血栓形成。目前已有多篇文献报道［8－9］，丹参酮ⅡA、丹皮酚单独使用对脑缺血具有保护作用。尼莫地平为钙拮抗剂，具有很强的亲脂性，容易透过血脑屏障，改善大脑微循环，临床上主要用于缺血性脑血管病等的治疗［10］，因此采用尼莫地平为阳性对照组。

据文献报道［11－12］，丹参酮ⅡA、丹皮酚都具有钙拮抗作用，本实验结果表明丹参酮ⅡA和丹皮酚配伍（1∶3）组（即50 mg∶150 mg）可明显改善脑缺血大鼠神经功能缺损症状（P＜0．01），降低脑梗死体积和脑含水量（P＜0．05），其药效最佳。丹参酮ⅡA和丹皮酚最佳配伍组药效优于丹参酮ⅡA或丹皮酚单独使用，丹参酮ⅡA和丹皮酚各配伍组、双丹胶囊组改善神经功能症状、降低脑梗死率和含水量的作用优于尼莫地平，提示丹参酮ⅡA和丹皮酚配伍用药是否在拮抗钙离子内流方面有协同作用，从而扩张血管，增加脑血流量。丹参酮ⅡA和丹皮酚配伍用药丹皮酚组降低脑梗死体积和脑含水量作用优于丹参酮ⅡA组和配伍（3∶1）组，提示丹皮酚在配伍组合中可能发挥主要的药效作用。这与中国药典双丹口服液处方（丹参600 g∶牡丹皮300 g）比例不符，而与文献报道［1］，丹参酮ⅡA与丹皮酚配伍对大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用，1∶3配伍组药效最优结论相吻合。同时丹参酮ⅡA和丹皮酚各配伍组降低脑梗死体积均比双丹胶囊组好，配伍（2∶2）组和（1∶3）组减少脑组织含水量也比双丹胶囊组效果好，提示临床防治脑血管病，丹参和牡丹皮主要的脂溶性有效成分组合比现有同类中成药复方制剂更具优势。

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