生物样品前处理研究进展

戴国梁，居文政，谈恒山 （．南京中医药大学药学院，江苏 南京009；．南京中医药大学附属医院临床药理科，江苏 南京009；．南京军区总医院临床药理科，江苏 南京000）

随着现代分析仪器及其软件的迅速发展，以及联用技术的广泛应用，生物样品分析技术得到了快速发展，并由传统的分离分析向不分离分析和计算解析相结合的方向迈进。原位、活体、实时分析系统也得到了广泛关注，这就给生物样品前处理提出了更高的要求：简便、快速、高效。

生物样品包括各种体液、组织以及分泌物，一般常用的有血液、尿液及组织液等。针对以上生物样品，通过查阅国内外相关文献，总结近年来蛋白沉淀、液－液萃取、固相萃取、固相微萃取、微透析等几种主要生物样品前处理技术，着重介绍每种技术的优缺点、适用范围及与检测仪器联用方面的内容，为科学工作者在处理生物样品方面提供借鉴。

1 蛋白沉淀、液－液萃取

1．1 蛋白沉淀 常用蛋白沉淀的方法有：盐析法，加有机溶剂、酸或者加热。蛋白沉淀法特别适用于强极性药物或两性类药物，这些药物难以用有机溶剂从血浆中提取。蛋白沉淀法因操作简单，在满足分析条件的情况下，应首先考虑该方法。

有机溶剂如甲醇、乙腈；无机盐如硫酸铵；酸性物如10%三氯醋酸是最常用的蛋白沉淀剂。当药物水溶性强时，一般使用甲醇和乙腈。当对药物定量回收要求高时，一般使用三氯醋酸。通常1体积的血浆加入1．5体积以上的乙腈或加入2体积以上的甲醇可以除去98%以上的蛋白质［1］，在达不到理想蛋白沉淀效率时，可考虑使用数种一定比例的混合试剂。但是，结合在血浆蛋白上的药物不一定会游离出来。

1．2 液－液萃取（liquid－liquid extraction，LLE） LLE一般用于提取亲脂性成分，而一般生物样品（血浆、尿液等）含有的大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质，因而用有机溶剂提取一次即可从样品中提取大部分药物。一般根据被测组分的极性来选择有机溶剂，被测组分极性较小时，应选择极性相对较弱的溶剂，如正己烷等；被测组分极性较强一般选用二氯甲烷、丙酮等，目前常用的还有乙酸乙酯、石油醚等。

1．3 液－液萃取新技术（liquid－phase microextraction，LPME）液相微萃取是在LLE基础上发展起来的，与LLE相比，LPME可以达到相同的灵敏度，同时所需溶剂更少，特别适合于生物样品中痕量、超痕量药物的测定。

LPME一般包括分散液相微萃取、单滴液相微萃取以及中空纤维液相微萃取等［2］。分散液相微萃取的萃取时间大为缩短，常与GC或HPLC联用测定生物样品中药物含量［3］。单滴液相微萃取采用微量注射器的针尖悬住一小滴有机溶剂，通过液相顶空或深入生物样品（如血浆）内部进行萃取。萃取一段时间后，回收微滴至注射器，直接进样分析［4］。中空纤维液相微萃取可有效减少生物样品中内源性物质的干扰，获得较好的加样回收率［5］。

2 固相萃取

2．1 固相萃取原理（Solid Phase Extraction，SPE） SPE适合多种生物样品中被测定组分的富集，是目前常用的前处理方法之一。SPE一般以吸附剂为固定相，当液体样品通过固定相时，保留其中某些组分，再用适当溶剂冲出杂质，然后用少量溶剂洗脱，从而达到分离、净化与浓缩的目的。SPE一般操作流程见图1。

图1 固相萃取操作流程Fig 1 The operation process of solid phase extraction

2．2 SPE适用范围 SPE可直接用于大多数液体生物样品的前处理（如血浆、尿等），另外固体、半固体样品（肝脏、脑等）经过处理后（可将固体、半固体匀浆，再液－液萃取，后萃取溶剂直接进固相小柱），也可使用SPE进行分离、富集。

2．3 SPE的应用 固相萃取常与分析仪器联合使用，相互补充，扩大使用范围，实现了前处理及分离分析的优化组合。当前常见的联用技术主要有固相萃取－液相色谱、固相萃取－气相色谱联用等。其中SPE－HPLC成为当前应用较多的一项在线联用技术。表1是近年来固相萃取在生物样品分析中的应用。

2．4 SPE的优势及局限性 SPE与LLE相比，有以下优势：（1）市场上已有成熟的商品小柱（如Waters公司的Oasis HLB小柱），易于获取；（2）回收率高；（3）分离速度加快；（4）不易产生乳化；（5）溶剂用量减少，极大的降低费用和危险性；（6）自动化程度高，与分析仪器的兼容性好。

当然，柱形SPE也有其不利一面：（1）截面积小，流量低；（2）易堵塞，尤其对生物样品；（3）易产生缝隙，降低提取效率；（4）重复性差。

表1 固相萃取－分析仪器联用在生物样品分析的应用Tab 1 Application of solid phase extraction－analytical system in biological sample analysis

2．5 新型固相萃取技术 涡流色谱技术是利用大粒径填料使流动相在高流速下产生涡流状态，从而对生物样品进行净化与富集。现已出现多种商品化的涡流色谱柱，满足生物样品中不同极性化合物的要求。涡流色谱可与液相色谱、质谱在线联用，对复杂生物样品直接进样测定，该技术已在生物样品分析中广泛应用。另外，污染物残留、柱寿命短是其主要缺点。微粒填料薄膜是近年来发展的高效、快速固相萃取新技术。它是由各种不同固定相填料微粒填充于薄膜介质中构成的，具有提取效率高、所需洗脱溶剂、填料少等优点，可用于尿液、血浆等生物样品的前处理。

此外新型固相萃取还有基质分散固相萃取、分子印迹固相萃取、磁力搅拌棒吸附萃取等技术。

2．6 SPE的发展趋势 SPE主要将会向3个方向发展：（1）改善SPE填料性能，开发出适用范围广的通用性填料或针对特定化合物的专属选择性填料；（2）与更多仪器实现在线联用；（3）使SPE小柱更加耐压且易于更换。

3 固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）

3．1 SPME原理 SPME是在固相萃取基础上发展起来的一种新型前处理方法。SPME保留了SPE所有的优点，摒弃了SPE需要柱填充物和使用溶剂的缺点，SPME基于液－固吸附、气－固吸附平衡原理，利用待测物在固定相涂层与样品之间的吸附平衡原理富集待测物，再通过解吸过程，使用与之相连的分析仪器对待测物进行分析，是集萃取、浓缩、解吸、进样于一体的样品前处理方法。

3．2 SPME适用范围 常见的SPME方法有直接取样（direct－SPME，DI－SPME）和顶空取样（headspace－SPME，HSSPME）。DI－SPME适用于气体或液体基质中大多数有机化合物的检测。HS－SPME可用于气／液平衡时气相浓度大于液相浓度的易挥发有机物的测定，适用于任何基质，特别适合含有挥发性或半挥发性待测物的生物样品。在上述2种基本萃取方法的基础上，还发展了管内SPME（in－tube SPME），该方法与HPLC在线联用，可直接进行样品分离分析，适用于GC不能测定的热不稳定成分［15］。

3．3 SPME的应用 SPME多与色谱装置联用，应用最广的是与GC联用。SPME－GC联用不仅可以实现完全在线联用，而且操作简单。但对于低挥发性或不挥发性的高极性化合物，SPME－HPLC更具优势。表2为近年来SPME在生物样品分析中的应用。

3．4 SPME的优势与局限性 与传统萃取技术相比，SPME有如下优点：（1）SPME不需要任何溶剂，减少环境污染；（2）SPME需要样品量少；（3）SPME与分析仪器联用有着良好的灵敏度；（4）便于与分析仪器联用；（5）可重复使用；（6）SPME可使用体积更小的进样口和内径更小的柱子。

同时，SPME仍有一定的局限性，如涂层种类较少，特异性差，无法用于生物大分子，涂层耐热性有待进一步提高等。

3．5 SPME的发展趋势 SPME装置的核心部分是涂层，涂层的厚度和种类在很大程度上决定了其灵敏度和选择性。目前商品化的SPME萃取头涂层较少［24］，且选择性差，难以满足不同性质生物样品分析要求。故研发新的涂层材料，甚至是选择性乃至特异性的涂层材料将是SPME得以进一步发展的关键。

4 微透析（microdialysis，MD）

4．1 MD原理 MD是基于“膜分离”原理的一项技术，兼“采样”与“前处理”于一体，所采样品可直接进样分析。MD系统一般由探针、连接器、收集器、灌流液和微量注射泵组成。同时，微透析常与高灵敏度分析系统在线联用，实现从样品的采集、处理到分析完全自动化。

4．2 MD适用范围 MD主要用于药动学和药效学研究，可在线连续监测体内体液浓度变化以及靶部位体液浓度变化。但是，由于半透膜技术发展的限制，现在MD技术主要用于采集生物样品中的亲水性小分子物质。

4．3 MD的应用 Shaw等［25］运用微透析技术和 HPLC测定兔服用“补阳还五汤”前后血液和脑中游离阿司匹林和水杨酸浓度的变化，证明中西药合用的安全性。Tettey－Amlalo等［26］利用皮肤微透析技术研究了酮洛芬凝胶剂在皮肤外用后的生物等效性。Wen等［27］运用微透析技术和LC－QTOF连续监测兔服用三七提取物12 h内胆汁中的代谢情况，从而鉴定出4个原型药和3个代谢物。

4．4 MD的优势与局限性 微透析在基本上不干扰体内正常生命过程的情况下进行在体、实时和在线取样，特别适用于研究生命过程的动态变化，另外样品的采集与分析过程既可离线也可在线检测。但是，该技术也存在一定的缺点：（1）缺乏准确易操作的探针回收率校准方法；（2）采集对象的局限性；（3）探针重复使用性较差，成本高。

表2 SPME在生物样品分析中的应用Tab 2 Application of solid phase microextraction in biological sample analysis

4．5 MD的发展趋势 微透析将向以下2个方面发展：（1）改善膜材料，实现采集对象由水溶性小分子物质向脂溶性大分子物质发展；（2）由单一成分单一部位采样向多成分多部位同步采样发展。

5 小结

近年来生物样品前处理技术发展迅速，出现了一些新方法、新技术，它们或是对原有技术的改良（如固相微萃取技术），或是与其他技术结合使用（如分子印迹技术与固相萃取技术的结合、固相萃取技术与超临界流体萃取技术的结合）。这些技术的出现促进并丰富了前处理技术。

现在的前处理技术正向所需样品和试剂消耗微量化，分离样品省时、高效、自动化，与分析仪器在线化以及低污染的环境友好型方向发展。可以预见不久的将来，大多数生物样品的分析将实现从样品的采集、处理、分离到分析完全自动化。

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