葱白中粗酶的性质考察

胡松，张耕，程璐 （武汉市中西医结合医院，湖北 武汉430022）

葱白是百合科（Liliaceae）植物葱AlliumfistulosumL．var．caespitosum Makino．的鳞茎。药理学研究表明，葱属植物具有抗菌、抗肿瘤及防治心血管疾病等功效［1－3］，葱白也不例外，以其为原料的相应产品的开发和应用有很好的前景［4－7］。与葱属植物大蒜相似，葱白中存在着蒜氨酸酶以及与其相应的有机硫化物底物，在葱白细胞被破碎时二者即结合生成丙酮酸和硫代亚磺酸酯类物质［8］。硫代亚磺酸酯类化合物是葱属各种植物中含硫化合物的前体物质，也是该属物质中众多生物活性的关键物质。该物质非常不稳定，很容易分解为各种含硫化合物。因此对葱白生物活性的研究及开发利用过程中，对含硫化合物的前体物质研究则成了关键之一，所以对其起重要作用的蒜氨酸酶的研究具有重要的意义。

现阶段，对葱白同属植物大蒜中蒜氨酸酶的研究已经很深入，但是关于葱白中酶的研究则鲜有报道。我们前期对葱白进行酶解和杀酶两种不同方法处理后进行了比较，发现其所含的有机硫化合物种类和数量出现明显差异［9］。虽然这两种物质中含硫化合物产生的原理相似，两种酶的功能也有一定的相似性，但是不同的酶之间，在理化性质及酶动力学特性上存在着差别。因此对新鲜葱白中提取的粗酶性质进行研究，可以为葱白的功效及开发利用提供一定的理论依据。

1 材料

紫外－可见分光光度计（日本岛津UV－1601）；匀浆机（九阳JYL－B011）；台式高速冷冻离心机（北京市医用离心机厂LGR10－4．2型）；电热恒温水浴锅（武汉市琴台医疗器械厂 HHS系列双列4孔）；电子天平（德国赛多利斯BP310S d＝0．001 g）；电子天平（德国赛多利斯 ME215S d＝0．1 mg）。

新鲜小葱（自种，经华中科技大学药学院张长弓副教授鉴定）；混合底物及粗酶（从新鲜葱白中提取，本课题组自制，批号分别为20110517和20110728）；丙酮酸钠（生化试剂Amresco，批号20110129）；其他试剂均为分析纯。

2 方法

2．1 测定波长的选择 精密称取丙酮酸钠110．0 mg（1 mmol），置于100 mL量瓶中，用纯化水稀释至刻度；移取该浓度下的丙酮酸钠溶液2 mL置于20 mL量瓶中，加入1 mL的2，4－二硝基苯肼试液（取2，4－二硝基苯肼试液100 mg，用2 mol·L－1的盐酸溶液溶解，稀释，定容至100 mL，摇匀，即得），摇匀，室温放置5 min，使其充分反应；再加入1 mol·L－1的氢氧化钠溶液5 mL，以纯化水定容至刻度，放置20 min，用相应的纯化水和显色剂做空白，在300～600 nm波长处进行全波长扫描。结果显示，经过显色反应后，丙酮酸分别在430 nm和520 nm处有最大吸收波长。但是在该反应体系中，430 nm处吸收峰的吸光度值受氢氧化钠浓度的影响较大［10］，而在520 nm处的吸光度值则较稳定，所以选择520 nm作为测定波长。

2．2 丙酮酸标准曲线的建立 精密称取丙酮酸钠55．16 mg，置于50 mL量瓶中，加入纯化水超声溶解，并定容至刻度线。取上述浓度样品3 mL，置于50 mL量瓶中，并加水稀释至刻度线。取分别取稀释后的样品0．5，1．0，2．0，3．0，4．0，5．0mL置于10 mL量瓶中，定容，即得系列标准溶液。取各样品7 mL置于20 mL具塞刻度试管中，然后分别向试管中加入2，4－二硝基苯肼试液1 mL，室温下反应5 min，然后加入1 mol·L－1氢氧化钠溶液5 mL，摇匀，室温下反应20 min，在定波长520 nm下测定各管溶液的吸光度值，以反应体系中丙酮酸的含量（X）对吸光度值（Y）作线性回归。得回归方程为Y＝5．419X＋0．012，r＝0．999 5，线性范围为0．015～0．15μmol。

2．3 葱白中粗制蒜氨酸酶活力的测定 精密称取粗酶样品于量瓶中，加水稀释并定容，得终浓度为2．5 mg·mL－1的供试品溶液。精密吸取供试品溶液3 mL，加混合底物2 mL，在35℃条件下准确反应5 min后，加入10%三氯醋酸溶液2 mL终止反应。然后分别向试管中加入2，4－二硝基苯肼试液1 mL，室温下反应5 min，然后加入1 mol·L－1氢氧化钠溶液5 mL，摇匀，室温下反应20 min，在波长520 nm下测定溶液的吸光度值。将酶活力定义为在指定条件下，单位时间内产生的丙酮酸的量，以反应速率V表示，单位为μmol／5 min。

2．4 反应时间对蒜氨酸酶活力的影响 精密称取粗酶样品62．96 mg，加纯化水稀释定容至25 mL，即得样品溶液。按照“2．5”项下的方法操作，分别测定酶促反应进行0．5，1．0，2．0，3．0，4．0，5．0，6．0 min时的反应速率。

2．5 温度对蒜氨酸酶活力的影响 分别测定酶促反应温度为10，20，30，35，40，50℃时的反应速率。

2．6 pH值对蒜氨酸酶活力的影响 用磷酸氢二钠和磷酸二氢钾配制成pH 值分别为3．0，4．0，5．0，6．0，7．0，8．0，9．0，10．0的缓冲溶液，用相应缓冲液溶解粗酶样品，分别测定不同pH值条件下的反应速率。

2．7 金属离子对蒜氨酸酶活力的影响 分别配制2 mmol·L－1的Fe3＋，Ca2＋，Cu2＋，Zn2＋溶液，用相应金属离子溶液溶解粗酶样品，分别测定不同金属离子溶液中反应速率。

2．8 不同灭活条件对葱白粗制蒜氨酸酶活力的影响 分别测定微波处理5 min后，90℃高温处理30 min后，甲醇溶解处理后的酶活，与未经任何处理的样品比较。

3 结果

3．1 反应时间对蒜氨酸酶活力的影响 从图1中可以看出，葱白中蒜氨酸粗酶的酶促反应非常剧烈，4 min内反应基本完成，4 min后反应速率基本稳定。

图1 反应时间对蒜氨酸酶活力的影响Fig 1 Effects of reaction time on the activity of alliinase

3．2 温度对蒜氨酸酶活力的影响 从图2可以看出，30℃后，粗酶的活力显著增加，在35℃附近达到最高峰，然后下降，40℃后又显著下降。葱白中蒜氨酸酶的最适温度范围为30～40℃，最适反应温度为35℃。

图2 温度对蒜氨酸酶活力的影响Fig 2 Effects of temperature on the activity of alliinase

3．3 pH值对蒜氨酸酶活力的影响 从图3可以看出pH值为6．0～8．0范围内时，蒜氨酸酶活力所受到的影响并不是很大。这一点说明，pH值在该范围时，比较适宜进行酶促反应。在这个范围外的酶活力显著下降，在该范围内，最适的pH值为6．2。

图3 pH值对蒜氨酸酶活力的影响Fig 3 Effects of pH value on the activity of alliinase

3．4 金属离子对蒜氨酸酶活力的影响 从图4可以看出，与纯化水组相比，Fe3＋、Cu2＋和Zn2＋对葱白中蒜氨酸酶的活力都有不同程度的抑制作用，特别是Fe3＋对蒜氨酸酶的抑制力达到了82．5%，Cu2＋和Zn2＋的抑制作用分别为77．3%和46．4%；而Ca2＋则表现出对蒜氨酸酶的激活作用，可以提高蒜氨酸酶的活力达133%。

3．5 不同灭活条件对蒜氨酸酶活力的影响 从图5中可以看出，微波，甲醇及高温这3种处理方式对葱白中蒜氨酸酶都有较好的灭火作用，其中灭活作用最明显的是微波处理方式，灭活率接近100%。其次分别为甲醇溶解处理和高温处理方式，灭活率分别为87%和80%。

图5 不同灭活条件对蒜氨酸酶活力的影响Fig 5 Effects of different inactivated ways on the activity of alliinase

4 讨论

酶的催化活性与环境的温度以及pH值有着密切关系。Mazelis等［11］在研究大蒜中蒜氨酸酶的性质中发现，在用磷酸盐作为缓冲液时，该酶的最适pH 值为6．6～6．7；郭娟等［12］对洋葱中蒜氨酸酶的性质研究结果表明，洋葱中该酶在pH5～8范围内有较高的活力，pH6．0时活性最高。而该实验的葱白中蒜氨酸酶在pH6．0～8．0范围内有较高的活性，pH6．2时活性最高。说明葱白中的蒜氨酸酶与大蒜和洋葱中的同类酶有一定的差异，而且在反应底物方面也有不同。

酶促反应中温度的控制也很重要，一般将酶促反应的温度控制在该酶的最适反应温度下，温度过高容易引起酶的变性而失活。有研究表明［13］，大蒜中蒜氨酸酶的最适反应温度为30℃。而该实验结果显示，葱白中蒜氨酸酶的最适反应温度为35℃，也说明了葱白和大蒜中的蒜氨酸酶存在着差异。

在研究金属离子对葱白中蒜氨酸酶活力影响的结果表明，除了Ca2＋对该酶表现出了激活作用外，其他的Fe3＋、Cu2＋和Zn2＋对葱白中的蒜氨酸酶均表现出明显的抑制作用。而王丹等［14］对大蒜中蒜氨酸酶粗提液的特性研究中显示，Zn2＋可以使大蒜中蒜氨酸酶的活性提高一倍，李燕等［13］的研究结果则说明了Zn2＋对新鲜大蒜中蒜氨酸酶的活性有抑制作用。郭娟等［12］对洋葱中的蒜氨酸酶的性质研究结果显示了Cu2＋、Ca2＋和Zn2＋对酶有不同程度的激活作用，而Fe3＋则表现出抑制作用［12，14］。这些结果说明，这一类的蒜氨酸酶有离子活性中心，这方面葱白与大蒜及洋葱均存在差异，而且同一酶在不同的反应底物条件下，离子活性中心的选择性可能存在差异。

葱白中的蒜氨酸酶与大蒜和洋葱中的酶存在着差异，且葱白中的含硫化合物类活性物质的产生又与该酶有密切的联系，故对葱白中蒜氨酸酶的研究以及对葱白的开发利用有着较为重要的作用。

［1］邹忠梅，于德泉，丛浦珠．葱属植物化学及药理学研究进展［J］．药学学报，1999，34（5）：395－400．

［2］Virginia L．The analysis of onion and garlic［J］．Journal of Chromatography A，2006，1112：3－22．

［3］Fanim M，Kohanteb J，Dayaghi M．Inhibitory activity of garlic（Allium sativum）extract on multidrug－resistant Streptococcus mutans［J］．J Indian Soc Pedod Prevent Dent，2007，25（4）：164－168．

［4］王进益，张介眉，雷健，等．搏心通胶囊对冠心病心绞痛患者脂质过氧化损伤的保护作用［J］．湖北中医杂志，2007，9（1）：30－32．

［5］何娟娟，张介眉，柯于鹤，等．搏心通胶囊治疗冠心病心绞痛疗效及其对血小板最大聚集率的影响［J］．内科急危重症杂志，2007，13（5）：141－143．

［6］张介眉，郭洁，涂欣，等．华夏小葱制剂对氧化低密度脂蛋白ox－LDL诱导内皮细胞损伤的影响及相关机制研究［J］．中西医结合学报，2007，5（6）：675－680．

［7］常青，赵立波，郝建军，等．华夏小葱制剂对大鼠脂肪肝防止机制的实验研究［J］．世界华人消化杂志．2007，15（7）：683－685．

［8］程龙军，郭得平．葱蒜类作物中的蒜氨酸酶［J］．植物生理学通讯，2001，37（5）：471－474．

［9］张耕，周银波，张长弓，等．酶解对鲜葱白中含硫化合物的影响［J］．中国医院药学杂志，2010，30（21）：1826－1828．

［10］Krst I，Glodek J，Keusgen M．Cysteine sulfoxides and alliinase activity of some Allium species［J］．J Agric Food Chem？，2000，48（8）：3753－3760．

［11］Nock P L，Mzaelis M．The C－S lyases of higher plants：Preparation and properties of homogeneous alliin lyase from garlic［J］．Arch Biochem Biophys，1986，249：27－33．

［12］郭娟，唐辉，芮鸣，等．洋葱中蒜氨酸酶的性质研究［J］．食品科技，2009，34（9）：72－74．

［13］李燕，王荣，李冠，等．新鲜大蒜中蒜氨酸酶的分离纯化及性质［J］．植物学通报，2005，22（5）：579－583．

［14］王丹，杨雪飞．蒜氨酸酶粗提液的特性［J］．安徽农业科学，2006，34（20）：5210－5211，5234．