不同炮制方法及提取溶剂对益母草有效成分含量的影响

程轩轩，桑雪雨，杨全，孟江，唐晓敏，张春荣 （广东药学院中药学院，广东 广州510006）

益母草为唇形科植物益母草LeonurusjaponicusHoutt．的新鲜或干燥地上部分。本品味苦、辛，性微寒；归肝、心包、膀胱经。具有活血调经，利尿消肿，清热解毒之功效。主要用于月经不调，痛经经闭，恶露不尽，水肿尿少，疮疡肿毒等症［1］。益母草历代本草未言其有毒，《本草纲目》、《本草蒙筌》皆言其“无毒”。但近代发现，鲜品及生品使用剂量过大或长时间应用，可产生毒副作用，毒理实验也证实了益母草的肾毒性［2－9］。中药经炮制后，可以达到减毒增效的目的。已有研究表明益母草经炮制后毒副作用显著降低［5－6］。为了探寻益母草的毒性物质基础，本实验考察了不同炮制方法和不同提取溶剂对益母草有效成分的影响，以期为临床安全、有效和合理用药提供实验依据。

1 材料

1．1 仪器 Waters 600E型高效液相色谱仪，Waters 2996二极管阵列检测器，Waters 717plus自动进样器；Empower色谱工作站软件；Milli－Q plus system超纯水仪（Millipore，Milford，MA，USA）；电子分析天平（Mettler Toledo，Swizerland）；KUDOS SK250LH超声波清洗器（上海科导超声波仪器有限公司）；EYELA旋转蒸发仪（Tokyo，Japan）。

1．2 试药 益母草购自广州清平药材市场，经广东药学院中药鉴定教研室杨全副教授鉴定为唇形科植物益母草（LeonurusjaponicusHoutt．）的干燥地上部分；酒炙和醋炙益母草均按照中国药典2010年版（一部）附录II D项下炮制方法加工；益母草碱、芦丁、金丝桃苷对照品（批号分别为90539－201009，90103－201008，90090－201107）均购自广州牌牌生物科技有限公司（纯度＞98%）。色谱纯试剂：乙腈（Honeywell，USA）；其他试剂均为分析纯；客家老黄酒（梅州市龙轩实业有限公司）；糯米白醋（广州市致美斋食品有限公司）。

2 方法与结果

2．1 色谱条件 Diamonsil®C18（2）色谱柱（4．6 mm×250 mm，5μm）SecurityGuardTMC18保护柱（4．0mm×3．0mm，5μm）；流动相：A为乙腈，B为10 mmol·L－1磷酸二氢钾溶液。梯度洗脱程序：0～10 min，13%～15%A；10～20 min，15%～16%A；20～30 min，16%～20%A；30～40 min，20%～45%A；40～50 min，45%～60%A。流速：1 mL·min－1。柱温：30℃。检测波长：275 nm（益母草碱），350 nm（芦丁、金丝桃苷）。进样量：10μL。

2．2 对照品溶液制备 分别称取益母草碱、芦丁、金丝桃苷对照品，精密称定，用70%乙醇溶解，使其质量浓度分别为2．23，2．34，2．82 mg·mL－1，作为储备液，密封避光，冰箱4℃保存，备用。临用前，用70%乙醇将储备液稀释到适当浓度，即为对照品溶液。

2．3 益母草不同炮制品的制备 参照中国药典2010年版附录II D“炮制通则”项下的方法制备酒炙和醋炙益母草。

2．4 供试品溶液制备 水提取液：分别取益母草药材的生品、酒炙品、醋炙品粉末（过80目筛）各2 g，精密称定。加纯化水100 mL，煮沸后再煮1 h，过滤，浓缩蒸干，70%乙醇定容至10 mL量瓶中。醇提液：分别取益母草药材的生品、酒炙品、醋炙品粉末（过80目筛）各2 g，精密称定。精密加入甲醇（或70%乙醇）超声提取3次（每次溶剂体积均为30 mL），每次提取30 min。合并滤液，浓缩蒸干，70%乙醇定容至10 mL量瓶中。用0．45μm的微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液。

2．5 含量测定的方法学考察

2．5．1 线性关系考察 精密吸取对照品储备液，用70%乙醇稀释配置6个浓度水平。按照“2．1”项下的色谱条件，将不同浓度的对照品溶液注入高效液相色谱仪，测定其峰面积。以对照品浓度X（μg·mL－1）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准工作曲线。回归方程、相关系数（r）、检测限（LOD）和定量限（LOQ）见表1。

2．5．2 精密度试验 取混合对照品溶液。按照“2．1”项下的色谱条件进行分析。日内测6次，连续测3 d，以峰面积积分值计算，益母草碱的日内与日间精密度分别为1．19%和1．38%，芦丁的日内与日间精密度分别为1．22%和1．76%，金丝桃苷的日内与日间精密度分别为1．45%和1．69%。

2．5．3 重复性试验 取益母草生品6份，精密称定，按“2．3”项下的方法制备供试品溶液（提取溶剂为70%乙醇），按照“2．1”项下的色谱条件，测定益母草碱、芦丁、金丝桃苷的含量。结果显示，3种有效成分的保留时间的RSD分别为0．41%，0．47%，0．56%；含量计算值的 RSD分别为1．18%，1．26%，1．57%。

2．5．4 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0，2，4，8，12，24 h进样，记录色谱图，测定益母草碱、芦丁、金丝桃苷峰面积的RSD分别为1．09%，1．27%，1．42%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2．5．5 回收率试验 精密称取已知含量的益母草生品药材6份，每份约2 g，精密称定，精密加入混合对照品溶液，按供试品溶液制备方法（提取溶剂为70%乙醇）得待测溶液，取10μL进样分析，计算益母草碱、芦丁、金丝桃苷的平均回收率分别为99．26%，100．23%，101．26%，其 RSD 均小于2%，见表2～4。

2．6 样品测定 按照“2．1”项下的色谱条件测定益母草不同炮制品的水提液、醇提液中益母草碱、芦丁和金丝桃苷的含量。结果见表5及图1～2。

表1 标准曲线数据表Tab 1 Calibration data for active constituents

表2 益母草碱的加样回收率试验（n＝6）Tab 2 Recovery test of leonurine（n＝6）

表3 芦丁的加样回收率试验（n＝6）Tab 3 Recovery test of rutin（n＝6）

表4 金丝桃苷的加样回收率试验（n＝6）Tab 4 Recovery test of hyperoside（n＝6）

图1 对照品色谱图Fig 1 HPLC chromatograms of referenc substances

表5 不同炮制品及不同提取溶液中益母草有效成分的含量（mg·g－1，n＝3）Tab 5 The content of active constituents in different processed products of Leonurus japonicus extracted by different solvents（mg·g－1，n＝3）

图2 益母草供试品色谱图Fig 2 HPLC chromatograms of crude product of Leonurus japonicus

3 讨论

益母草传统炮制方法繁多，现代炮制方法多采用净制、酒制和醋制。根据传统的用药习惯以及有效成分的理化性质，本实验分别选用水、70%乙醇和100%甲醇作为提取溶剂。结果表明：益母草碱和芦丁的溶剂提取效率：70%乙醇＞水＞甲醇；金丝桃苷的溶剂提取效率：70%乙醇＞甲醇＞水，从而确定70%乙醇为最佳提取溶剂（与药典中益母草项下所选提取溶剂一致）。在益母草的不同炮制品中，益母草碱、芦丁和金丝桃苷3种成分含量：生品＞醋炙品＞酒炙品。

针对目前益母草引起中毒反应的临床报道，药理实验研究也表明益母草是具有肾毒性的中药，且经过炮制后可起到降低毒性的作用，但其毒性物质基础尚不清楚［2－9］。据报道，益母草醇提物长期给药后可导致大鼠明显的肾毒性损伤，其损伤程度呈现一定的剂量依赖关系，且醇提物与益母草总生物碱的含量呈正相关，由此初步判定生物碱类成分是益母草导致肾毒性的物质基础［2，11］。在金丝桃苷长期毒性研究中发现［10］：金丝桃苷的中、高剂量组大鼠肾脏会出现特异性损伤，体现在肾脏出现不同程度的炎症细胞浸润，个别大鼠肾小管内发现蛋白管型等。本研究表明：益母草药材的炮制品中，生物碱和黄酮类化合物的含量均低于生品。炮制后药材中益母草碱与金丝桃苷的含量显著降低，因此推断二者可能为益母草药材的毒性来源成分之一。为了全面了解益母草的毒性物质基础，以及与功效物质基础的相关性等问题还需要作深入研究。

［1］中国药典．一部［S］．2010：273．

［2］黄伟，孙蓉．益母草醇提组分致大鼠肾毒性病理损伤机制研究［J］．中国实验方剂学杂志，2010，16（9）：111－114．

［3］黄伟，孙蓉．益母草肾毒性与氧化损伤机制的相关性研究［J］．中药药理与临床，2010，26（2）：54－56．

［4］张文彦，刘艳丽．太行山野生益母草不同采摘期及不同部位的质量分析［J］．中国医院药学杂志，2011，31（12）：1038．

［5］孙蓉，吴旭东，刘建伟，等．雷公藤、关木通、益母草对大鼠肾毒性的比较研究［J］．中药药理与临床，2005，21（2）：26－28．

［6］黄伟，孙蓉，张作平，等．益母草不同炮制品的小鼠急性毒性实验研究［J］．中国药物警戒，2010，7（2）：65－69．

［7］罗毅，冯晓东，刘红燕，等．益母草总生物碱对小鼠肝、肾的亚急性毒性作用［J］．中国医院药学杂志，2010，30（1）：7－10．

［8］刘红燕，罗毅．益母草石油醚提取物对大鼠肾小管上皮细胞的毒性研究［J］．武警医学院学报，2008，17（12）：1096－1098．

［9］于华芸，季旭明．益母草的毒性毒理研究概况［J］．湖南中医杂志，2008，24（2）：112－113．

［10］艾国，黄正明，王德文，等．金丝桃苷对Wistar大鼠重复灌胃给药的毒性研究［J］．中国新药杂志，2012，21（23）：2811－2816．

［11］吕丽莉，黄伟，于晓，等．益母草醇提物对大鼠肾毒性损伤作用研究［J］．中国药物警戒，2009，6（9）：513－518．