国药沉香结香真菌的分离鉴定及分析

马华明 ，梁坤南 ，周再知 ，杨 伟

国药沉香结香真菌的分离鉴定及分析

马华明 ，梁坤南 ，周再知 ，杨 伟

(中国林业科学研究院 热带林业研究所，广东 广州510520)

对采自广东省电白县的土沉香分创伤组和结香组进行真菌分离培养，通过rDNA中内转录间隔区(ITS)序列鉴定其为10个种。从创伤组来看，创伤短期之内，其真菌种类出现了增多的现象，这一阶段是始结香的前期，大量的致病菌的侵染可能导致结香的发生，创伤结香过程与致病菌有着必然联系。从结香组来看，未结香、始结香和已结香部分的真菌种类则依次减少，始结香部分和已结香部分的的真菌多数相同，包括多变根毛霉Rhizomucor variabilis、再育镰刀菌Fusarium proliferatum和哈茨木霉Hypocrea lixii，这些真菌能促进沉香的形成。

土沉香；真菌；分子鉴定；ITS 区

土沉香Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg.又名白木香、莞香、女儿香，是瑞香科Thymelaeaceae沉香属Aquilaria木本植物，为国家二级濒危保护植物。土沉香是我国生产名贵中药材沉香的唯一来源，在我国药用历史悠久。此外，在日本、印度以及东盟国家，沉香也是传统名贵药材和天然香料。我国中医认为，其味辛、苦，性微温，能行气止痛、温中止呕、纳气平喘[1]。瑞香科Thymelaeaceae沉香属Aquilaria spp.的部分种和拟沉香属Gyrinops spp.的部分种，经人为或自然方式使其树干木材组织在胁迫条件下发生生物化学过程，酯类物质逐渐增多并积累于木材中，形成了沉香，这一过程又被称为结香。能生产沉香的植物统称沉香木，印度、中国、东南亚是沉香的主产国，栽培最为广泛的沉香木有马来沉香A. malaccensis、奇楠沉香A. crassna和我国的土沉香A. sinensis。

由于沉香形成过程极其复杂，国内外的学者都做了很多研究。国外早期的研究认为，沉香的形成可能是树干受到伤害后被真菌侵染，真菌的代谢产物使木材薄壁细胞的淀粉粒发生生物化学变化，形成脂类，经多年沉积而形成沉香[2-3]，从沉香属植物树体的结香部位分离到的真菌种类很多，包括砖红镰孢Fusarium laseritum、青霉Penicillium spp. 、曲霉Aspergillus spp. 、毛霉Mucor spp. 、色二孢菌Diplodia spp.、可球二孢菌Botryodiplodia theobromae、木霉Trichodermaspp.、 裂褶菌Schizophyllum spp. 、镰刀菌Fusarium spp.等[3-8]。在国内，也有学者分离出黄绿墨耳菌Menanotus flavolives[9]，并认为它与沉香形成有关，做了大量的实验[10-12]支持其观点，但张争等[13]对这一研究成果提出了质疑。近年来，王磊等[14]对土沉香内生真菌作了较为全面的研究，分离出了50个菌株，但未将研究重点放在结香这一层面上。为了探索真菌在结香过程中的变化情况，笔者精心设置了人工创伤试验，并从结香的角度分析了创伤前后的真菌情况；还根据不同结香程度，对结香过程中的真菌类别作了阐述，本研究内容在国内尚属首次，旨在揭示结香过程与真菌之间的关联，为将来开展结香真菌筛选与接菌结香技术的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

在广东省电白县采集试验样品，土沉香由中国林科院热带林业研究所森林培育实验室鉴定，分离真菌所用的样品材料分为两组：A组为创伤组，即在选取胸径30 cm以上的3株成年土沉香，在树干上从离地面40 cm、70 cm和100 cm处钻一个直径约10 cm深至髓心的水平孔，孔径2 cm，钻后第0天、90天和180天分别取一个孔周（不含表层）木材作为分离真菌的材料，代表不同创伤时间样品；B组为结香组，选经鉴定已结香的沉香树3株，根据不同结香程度分别取样作为分离真菌的材料，即未结香（色泽仍为白木）、已结香（与成品沉香色泽一致）和始结香（位于未结香和已结香之间的过渡带，色泽较成品沉香浅），代表不同结香程度样品。样品自植物体取下后，用无菌水反复冲洗，再用滤纸吸干样品表面的水分，用密封袋装好后带回实验室。

1.2 分离纯化菌株

预先备好用于分离真菌的综合PDA培养基。取回的样品需先在0.1% 的HgCl2溶液中浸泡1 min，取出用无菌水冲洗，再用75%乙醇中浸泡1 min和无菌水冲洗，然后在超净工作台将样品放入备好的培养皿。将培养皿置于26 ℃ 恒温培养箱，待形成菌落后，根据菌落特征，挑取单一菌落的菌丝转接至新的培养皿，继续在26 ℃下恒温培养。经多次分离直到纯化，所获菌株转接试管保存备用。

1.3 DNA制备

从培养皿上挑取少量菌丝体移入已灭菌的1.5 mL微型离心管中，加入30 µL 尿素提取液(1.5% SDS，7 mol/L尿 素，0.05 mol/L Tris-HC1 pH 8.0，0.5 mol/L NaCl)，捣碎材料，然后将材料置于液氮中冷却，再取出继续捣碎至融化，如此反复3次。之后，加入尿素提取液300 μL，在液氮中冷却后置于65℃迅速融化，反复冻融3～4次后，再加入等量的V(酚)∶V(氯仿)∶V(异戊醇)=25∶24∶1，在13 000 r/min下离心10 min。取上清液加入等量(氯仿) ∶V(异戊醇)=24∶1，于13 000 r/min下离心10 min。再取上清液，加入微量RNase A，置于37 ℃恒温箱中30 min。最后，加入3倍体积无水乙醇，3 mo/L NaAc(pH 5.2)，在-20 ℃放置30 min 以上后，13 000 r/min离心15 min。取沉淀物，分别用70%乙醇和无水乙醇洗涤，风干后加入50 µL TE回溶。取1 μL回溶液在1%的琼脂糖凝胶上作电泳检查，其余置于-20 ℃下保存备用。

1.4 PCR扩增与测序

通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'， 正 向)和ITS4(5'-TCCTCCGCTrATrGATATGC-3'，反向 )扩增分离菌株的rDNA内转录间隔区(ITS区)，采用Ex Tag(TaKaRa)进行PCR反应。反应条件:首先，93 ℃预变性3 min；然后，93 ℃变性1 min，53 ℃复性1 min，72 ℃延伸1.5 min，共30个循环；最后，72 ℃延伸 10 min。

用PCR产物纯化试剂盒(QIAGEN)纯化反应产物，纯化后则用Tag I及Hha I 2种限制性内切酶(TaKaRa) 进行酶切分型，依分型结果进行测序。

1.5 菌株鉴定

运行blast程序，对测序所获序列在GenBank上进行相似性检索，根据blast结果，确定分离菌株的种类。对于无法确定的分离株，将其序列以及近似序列导入MEGA version 3.1[15]中进行比对，采用邻位互换算法(CNI)搜索最小进化树(ME tree)，并进行l 000次重复的自展检验(bootstrap)，ME树上与之最接近的种类则为分离菌株可能的种类。

2 结果与分析

2.1 创伤与真菌关系

土沉香树干经创伤后，随着时间的推移，在伤口无法愈合的情况下，会形成沉香，但这是一个缓慢的过程并受当地环境影响，时间的长短并不确定。在本试验中，创伤180 d时仍处于未形成沉香的阶段。

从表1中可以看出，创伤0天（即未创伤）时，样品中仅分离出哈茨木霉Hypocrea lixii。哈茨木霉是一种植物益生菌，除了它的代谢产物有助于植物对水分和养分的吸收外，它还是一个菌寄生真菌，被广泛应用于植物真菌病害防治，它至少可寄生于18个属中的29种植物病原真菌，哈茨木霉菌主要通过识别寄主后缠绕寄主真菌的菌丝，随后产生细胞壁降解酶和抗生素以及对空间和营养的竞争机制达到防治植物病原菌的目的[16-17]。正常生长的土沉香素有“百年白木”之说，或许跟存在哈茨木霉有一定的关联。创伤90天后，除了哈茨木霉，还出现了一个致病菌—可可毛壳色单隔孢Lasiodiplodia theobromae，而创伤180 d后，还出现了茄病镰刀菌Fusarium solani、弯孢菌Curvularia spp.和小孢拟盘多孢Pestalotiopsis microspora这3个菌种，这3个菌种均为致病菌。综上所述，当土沉香受到创伤之后致病菌会随之增加，可以推断，创伤结香过程与致病菌有着必然联系，而且这一过程是多种致病菌共同作用的结果，由于创伤之后出现的致病菌在未创伤树干组织并未发现，推断这些致病菌是通过创伤伤口从外界进入的。

表1 不同创伤时间的样品真菌种类Table 1 The fungi species in samples from hurted trunk with different time

2.2 结香程度与真菌关系

结香组样品中未结香部分从表观上未有结香迹象（即仍为白色），但从分离的真菌种类来看，该部分的真类种类最多，有5种，均为致病菌（见表2）。通常，在自然状态下，木材组织由健康白木向沉香转变的过程是一个漫长的过程，少则几年多则几十年，结香组样品中未结香部分正处于这一变化过程中，这部分出现了多种真菌，说明，未结香部分朝着结香方向变化需要多种真菌参与才可能发生。就真菌种类而言，按未结香→始结香→已结香顺利依次减少，而且前者与后两者分离的真菌大多数不是同种，这说明随着沉香物质的形成对某些真菌有一定的抑制作用，这些真菌难以生存，取而代之的是其它的真菌，但总的菌种种类会随之减少。在有沉香物质的部分，即始结香部分和已结香部分，真菌比较接近，都发现了再育菌刀菌Fusarium proliferatum和多毛孢菌Pestalotiopsis palmarum，均为致病菌，这些致病菌仍能在含沉香特质的木材中生存，仍能促进沉香物质的形成。可见，沉香的形成过程并不是某一些真菌自始至终的结果。

表2 不同结香程度的真菌种类Table 2 The fungi species in no-agar wood, little-agar wood and agar wood of samples

3 讨 论

本试验所分离菌株通过rDNA中内转录间隔区(ITS)序列鉴定，均具有99%以上的相似序列，其中确定至种名的有9种，仅确定至属名的有1种。

从创伤组来看，创伤短期之内，其真菌种类出现了增多的现象，但本试验只考察到创伤180天菌种，从结香过程来看，180天仍处于未结香阶段，这一阶段是始结香的前期，大量的致病菌的侵染才可能倒致结香的发生，这与结香组的样品菌类分析结果是一致的，即未结香部分真菌种类较多。

从结香组来看，在有沉香物质的部分，即始结香部分和已结香部分，都发现了多变根毛霉Rhizomucor variabilis、再育镰刀菌Fusarium proliferatum和肉座菌Hypocrea lixii，从始结香到已结香，它们并没有由于沉香物质的增多而消亡，可以认为它们的存在与沉香物质的增多有一定的关联性，换言之，它们促进了沉香物质的形成。

综合创伤组和结香组的真菌种类来看，发现：(1)创伤之后的样品和结香组的样品并不存在相同的真菌，唯一共同之处在于所分离的真菌均为致病菌，可见，沉香结香过程与致病菌有关，可能还是多种致病菌共同作用的结果，该结论与国外的研究一致[2-3]；(2)一旦木材组织受到创伤，侵染的真菌会呈增加的趋势，但当有沉香物质形成以后，一些真菌会消亡，相应地真菌种类会逐渐减少。

值得一提的是，本文在结香部位所分离出的菌株与国外的研究不尽相同，可能是样品的地域性所致，即每一样品的真菌种类与该样品所处的环境悉悉相关，但同时也说明不同地区的沉香形成所需的微生物是不同的，换言之，沉香的形成并不是某一特定真菌作用的结果。本文所揭示的土沉香结香与致病真菌之间的关系，对我国开展人工接菌结香技术生产国药沉香具有一定的指导意义。

[1] 国家药典委员会.中国药典[M]. 北京：中国医药科技出版社，2010.

[2] Tamuli P , Boruah P , Samanta R. Biochemical changes in agarwood tree ( Aquilaria malaccensis Lamk. ) during pathogenesis [J]. Journal of Spices and Aromat Crops, 2004, 13:87-91.

[3] Ng L T , Chang Y S , Azizol L K. A review on agar (gaharu)producing Aquilaria species [J]. Journal of Trop for Products,1997 , 2 (2) : 272-285.

[4] Bose S R. The nature of agar formation [J]. Science Culture,1934，4 (2) ： 89-91.

[5] Bose S R. Enzymes of wood-rotting fungi [J]. Ergeb Enzymforsch , 1939, 8 : 267-276.

[6] Subeham , J unya U , Fujino H , et al. A field survey of agarwood in Indonesia [J]. Journal of Trad. Med., 2005 , 22 (4) : 244-251.

[7] Gibson I A S. The role of fungi in the origin of oleoresin deposit(Agaru) in the wood of Aquillaria agallocha (Roxb1 )[J]. Bano Biggyn Patrika, 1977, 6 (1) : 16-26.

[8] Qi S Y, Lu B Y, Zhu L F , et al. Formation of oxoagarospirol in Aquliaria sinensis [J ]. Plant Phys. Commun., 1992, 28: 336-339.

[9] 曾幻添，董文忠，吴质朴. 沉香的人工结香[J].中草药通讯，1978,(12):38-40

[10] 戚树源，林立东，叶勤法. 沉香中节基丙酮及其在黄绿墨耳真菌中的生物转化[J].生物工程学报，1998,14(4):464-466

[11] 戚树源，陆碧瑶，朱亮锋，等. 白木香中白木香醛形成的研究 [J]. 物生理学通讯, 1992, 28 (5):336-339

[12] 戚树源，林立东，胡厚才. 白木香中色酮类化合物的形成[J]. 中草药，2000,31(9):658-659

[13] 张 争，杨 云，魏建和，等. 白木香结香机制研究进展及其防御反应诱导结香假说[J]. 中草药，2010,41(1):156-159.

[14] 王 磊，章卫民，潘清灵，等. 白木香内生真菌的分离及分子鉴定[J]. 菌物研究，2009, 7(1):37-42.

[15] Kumar S，Tamura K， Nei M． MEGA3:Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment[J]．Briefings in Bioinformatics，2004，5(2):150-163．

[16] 石一珺，申屠旭萍，俞晓平. 重寄生菌哈茨木霉的研究及其在植病生防中的应用[J]. 生物技术通报, 2008,(增刊):76-78.

[17] 汪腾越，周再知，裘珍飞，等.土沉香组织培养外植体消毒方法的研究[J].中南林业科技大学学报, 2012, 32(3):44-48.

Isolation, identification and analysis of fungi of agarwood formation

MA Hua-ming, LIANG Kun-nan, ZHOU Zai-zhi, LIN Ming-ping, , YANG Wei
(Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou 510520, Guangzhou, China)

The fungi were isolated from two groups of samples of Aquilaria sinensis at Dianbai, Guangdong province, including the trauma group and agarwood group. Ten fungi species were identified by DNA sequence of ITS regions. It was found that the pathogenic fungi species increased quickly in the short time after the trunk hurted. It was shown that the pathogenic fungi were correlative with agar formation, in another word, the pathogenic fungal infection would induce agar formation after the trunk hurted. Moreover, the fungi species were analyzed based on agarwood group, which was divided into three parts including no-agar wood, little-agar wood and agar wood, it was found that the pathogenic fungi species number was the maximum in the no-agar wood part, and the pathogenic fungi species numbers were fewer in the little-agar wood and agar wood. Most of fungi in the little-agar wood part and agar wood part were the same. The fungi and Rhizomucor variabilis, Fusarium proliferatum, and Hypocrea lixii played an important role in agar formation.

Aquilaria sinensis；endophytic fungi；molecular identification；rDNA ITS

S759；Q949.761.1

A

1673-923X (2012)07-0072-04

2012-04-01

林业公益性行业科研专项“热带珍贵树种良种选育和高效培育技术研究”（201204301-1）;国家中央级科研究院所基金项目“土沉香结香真菌筛选与结香技术研究”（RITF2010-08）

马华明(1977—)，男，福建连城人，助理研究员，从事沉香产香技术的科研工作；E-mail：fjmhm@163.com

[本文编校：吴 毅]