麻疯树种子总RNA提取方法研究

丁 勇，范红波，张高磊，严宇庭，李瑞阳

麻疯树种子总RNA提取方法研究

丁 勇，范红波，张高磊，严宇庭，李瑞阳

（西南林业大学 西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室，云南 昆明 650224）

采用RNAiso Plus法、RNApure Plant Kit法和改良CTAB法分别提取麻疯树种子总RNA，以期筛选适合于麻疯树种子高质量总RNA提取方法。用琼脂糖甲醛变性凝胶电泳检测总RNA的完整性，以紫外分光光度计检测总RNA的纯度和得率。结果表明：RNAiso Plus法提取麻疯树种子总RNA的A260/A280比值为2.030，28S和18S rRNA条带清晰，且前者的亮度约为后者的2倍，无可见的弥散现象，利用该方法提取的总RNA进行RT-PCR，成功克隆获得了麻疯树oleosin基因长603 bp的cDNA序列。证明RNAiso Plus法提取麻疯树种子总RNA可满足后续RT-PCR、RACE-PCR和基因全长克隆等分子生物学研究。

麻疯树；种子；RNA提取；反转录聚合酶链式反应

麻疯树(Jatropha curcas L.)又名小桐子、膏桐等，是大戟科(Euphorbiaceae)麻疯树属(Jatropha)多年生亚乔木[1]。麻疯树种子富含大量的油脂，可作为理想的生物柴油，并作为柴油机燃料的替代品开始凸显其重要性[1-3]。含油植物种子中积累的油脂主要是以三酰甘油(Triglycerides，TAGs)的形式储藏在油体(Oil Bodies，OBs)中[4-5]。研究表明油体膜蛋白(Oil-body-membrane Proteins)对于植物油体的形成与稳定起着重要作用[6-8]。因此，为了深入开发利用麻疯树种子的经济价值，研究麻疯树种子油体膜蛋白及其基因已经成为当务之急，而从麻疯树种子中分离高质量的总RNA却是关键。麻疯树种子在发育成熟过程中合成并积累大量的油脂、毒性化合物和次生代谢产物，尤其是在发育4～5周的种子中显著富集[9]，这些化合物会直接影响植物组织RNA的有效提取[10-11]。虽然已有少量关于麻疯树种子总RNA提取的报道[12-14]，但仍比较薄弱。本试验比较研究了RNAiso Plus法、RNApure Plant Kit法和改良CTAB法等3种方法提取麻疯树种子总RNA，以期筛选从麻疯树种子中提取高质量总RNA的最佳方法，为开展麻疯树种子后续mRNA分离和油体膜蛋白基因克隆等研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料和试剂

试验材料是种植于中国科学院西双版纳植物园的3年生麻疯树植株。待麻疯树开花后4～5周，取其未成熟种子，-80 ℃冰箱中保存备用。RNA提取时，去除种壳，种仁置于液氮中研磨。

研钵、研杵和玻璃制品均在180 ℃烘烤8 h以上，进行无RNA酶处理；用0.1% DEPC水配制试剂和浸泡离心管、枪头等聚乙烯塑料制品，室温处理至少24 h后在121 ℃下高温高压灭菌30 min。

RNAiso Plus试剂购自宝生物工程(大连)有限公司；RNApure Plant Kit购自康为世纪(北京)生物科技有限公司；其他化学试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2 RNA提取方法

RNAiso Plus法根据TaKaRa试剂盒说明书操作。RNApure Plant Kit法根据康为世纪生物科技有限公司试剂盒说明书操作。改良CTAB法根据丁勇等[15]报道的方法改良而成，操作步骤如下：

①取0.15 g麻疯树种仁，加液氮研磨至粉状，转移至2 mL离心管中。加入65 ℃预热的提取缓冲 液 [0.1 mol/L Tris-HCl(pH值 8.0)，0.05 mol/L EDTA(pH 值 8.0)，2% CTAB(W/V)，2% PVP(W/V)，2 mol/L NaCl，2% β-ME(V/V)] 600 μL，盖紧管口，涡旋混匀，然后65 ℃温育30 min，期间每隔5 min摇匀1次。

②加入等体积的氯仿：异戊醇(24∶1)，涡旋混匀，于4 ℃，12 000 r/min离心10 min，取上清液至另一个新的2 mL离心管中。重复抽提1～2次。

③取上清液至另一个新的2 mL离心管中，加入1/10倍提取液体积的10 mol/L LiCl，混匀，-20 ℃放置3 h后，于4 ℃，12 000 r/min离心10 min。

④弃上清，沉淀溶于75 µL DEPC水中，加入60 µL 3 mol/L NaAc(pH值5.2)和2.5倍提取液体积的预冷的无水乙醇，混匀，-80℃放置30 min后，于4℃，12 000 r/min离心20 min。

⑤弃上清，RNA沉淀用1 mL预冷的70%乙醇清洗1～2次。

⑥总RNA沉淀于超净工作台中干燥，变透明即可。

⑦总RNA溶于50 µL DEPC处理的无RNase水中，放置-80℃备用。

1.3 总RNA纯度及完整性检测

5 μL总RNA在1.2%琼脂糖甲醛变性凝胶中电泳，紫外成像系统下观察，检验总RNA完整性。2 μL总RNA用DEPC处理的无菌水稀释200倍，加入到比色皿中，采用Biochrom Libra S22-紫外分光光度计测定总RNA的含量及纯度。

1.4 RT-PCR

试验设计麻疯树油质蛋白oleosin基因的同源性简并引物对，用M-MLV反转录酶(TaKaRa)分别将三种方法提取的麻疯树种子总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR。反应体系：10×PCR Buffer 2 μL，dNTP(each 10 mmol/L)0.4 μL，上下游引物 (10 μmol/L) 各 1 μL，反转录产物 cDNA 2 μL，MgCl2(25 mmol/L)1.6 μL，Taq 酶0.2 μL，加dd H2O至总体积20 μL。PCR循环条件：94℃ 3 min；9 4℃ 30 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。

2 结果与分析

2.1 麻疯树种子总RNA纯度分析

本研究试验了RNAiso Plus法、RNApure Plant Kit法和改良CTAB法提取麻疯树种子总RNA，经紫外分光光度计检测，总RNA的A260/A280比值、浓度和得率，以及试验所需时间等结果如表1显示。RNAiso Plus法和RNApure Plant Kit法提取总RNA的A260/A280比值分别为2.030和1.881，表明RNA纯度较好，无蛋白质、多糖和酚类物质等杂质污染。改良CTAB法提取总RNA的A260/A280比值为1.723，表明RNA的纯度较差，不能有效去除总RNA样品中蛋白质、多糖和酚类物质等杂质。从总RNA得率来看，RNAiso Plus法最高，为 2.460 µg/g(RNA/样品 )；RNApure Plant Kit法次之，为 1.807 µg/g(RNA/样品)；改良CTAB法最低，仅为0.359 µg/g(RNA/样品)。从试验所耗时间来看，RNApure Plant Kit法所需时间最短，仅需2.5 h；改良CTAB法所需时间最长，耗时12 h；RNAiso Plus法适中，需4 h。综合试验数据表明RNAiso Plus法和RNApure Plant Kit法抽提获得的麻疯树种子总RNA纯度较好，改良CTAB法没有从麻疯树种子中提取获得纯度好的总RNA。

表1 3种方法提取麻疯树种子总RNA纯度分析Table 1 Purity comparison of total RNA extraction with three methods from seeds of Jatropha curcas L.

2.2 麻疯树种子总RNA完整性分析

三种方法提取的麻疯树种子总RNA完整性由图1的电泳结果显示。RNAiso Plus法获得的总RNA完整性好，28S和18S rRNA条带清晰可见(如图1-A)，且前者的亮度约为后者的2倍，无弥散现象，点样孔中无亮斑现象，表明RNA完整，既无DNA存在，又无蛋白质和多糖等杂质污染。RNApure Plant Kit法提取的总RNA虽可见28S和18S rRNA条带(如图1-B)，但28S rRNA条带亮度没有18S rRNA条带的强，有可见的弥散现象，推测RNA存在一定的降解现象。应用改良CTAB法提取获得的总RNA完整性较差，28S和18S rRNA条带模糊(如图1-C)，具明显的弥散现象，表明总RNA存在较严重的降解现象。表明RNAiso Plus法提取的麻疯树种子总RNA完整性较好，RNApure Plant Kit法和改良CTAB法抽提的麻疯树种子总RNA完整性较差。

2.3 RT-PCR检测

图1 3种方法提取麻疯树种子总RNA的甲醛变性凝胶电泳Fig.1 Denaturalization formaldehyde agarose gelelectrophoretogram of total RNA extraction with three methods from seeds of Jatropha curcas L.

RT-PCR扩增产物经琼脂糖电泳检测结果显示，利用RNAiso Plus法获得的麻疯树种子总RNA为模板进行RT-PCR能够成功获得1条特异性cDNA片段(如图2)，克隆测序确定为麻疯树oleosin基因的部分cDNA序列，长603 bp。而利用改良CTAB法和RNApure Plant Kit法获得的麻疯树种子总RNA为模板进行RT-PCR扩增，没有获得理想结果。表明RNAiso Plus法所提取的麻疯树种子总RNA能满足后续的RT-PCR和全长基因克隆等分子操作的要求。

图2 以RNAiso Plus法提取的麻疯树种子总RNA为模板进行oleosin基因cDNA片段扩增结果Fig.2 Amplification of partial cDNA of Oleosin gene with RNA as templates isolated by RNAiso Plus method from seeds of Jatropha curcas L.

3 讨 论

含油植物种子在发育期间表达的油体膜蛋白主要有oleosin、Sop1、Sop2和Sop3[16]。油体膜蛋白基因在早期发育的种子中表达量低，当种子达到最大鲜重并开始脱水时基因高水平表达[17]。为了后续研究麻疯树种子油体膜蛋白及其基因需要，研究选择了麻疯树开花后4～5周的未成熟种子来进行RNA提取试验。

RNA是一种极易降解的核酸分子，获得纯度高、完整性好的RNA是后续分子生物学试验成功的关键。在麻疯树种子发育成熟过程中，油体膜蛋白基因丰度表达[17]，同时显著富集大量的油脂、毒性化合物和次生代谢产物[9]，这些特殊成分干扰了总RNA的抽提。已报道的麻疯树种子总RNA提取方法[12-14]仍比较薄弱。本研究应用的改良CTAB法操作复杂，耗时较长，提取的总RNA纯度和完整性最差，得率最低；RNApure Plant Kit法虽操作最简单快捷，但提取的总RNA完整性也较差，得率也较低；这两种方法提取的总RNA经反转录进行RT-PCR，均不能获得目的基因片段，证明此两种方法不适合用以提取麻疯树种子总RNA。

RNAiso Plus法适宜从麻疯树种子中提取获得纯度和完整性较好的总RNA。RNAiso Plus主要成分为异硫氰酸胍和8-羟基喹啉。高浓度强变性剂异硫氰酸胍使细胞结构迅速被破坏，使RNA从细胞中释放出来，同时高浓度异硫氰酸胍还使细胞内的RNA酶失活，使释放出的RNA不被降解。8-羟基喹啉可以抑制RNA酶。后续加入氯仿，其作用一是与8-羟基喹啉联合使用可增强RNA酶抑制作用；二是作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去，同时也通过变性作用抑制RNA酶活性；三是作为溶剂抽提样品中的脂溶性杂质(比如油脂等)，起着一定除杂作用。此法操作简单快捷。试验中，样品在RNAiso Plus中充分被裂解，在加入氯仿离心后，溶液会形成无色上清层、白色中间层和红色有机下面层，收集含RNA的上清层后，经异丙醇沉淀便可回收获得总RNA。利用此法提取的总RNA进行RT-PCR，成功克隆获得了麻疯树oleosin基因长603 bp的cDNA序列，证明RNAiso Plus法提取获得的总RNA能够满足后续mRNA分离、RT-PCR、麻疯树种子相关基因克隆等分子生物学试验。

[1] Openshaw K.A review of Jatropha curcas： an oil plant of unfulfilled promise[J].Biomass Bioenergy, 2000, 19： 1-15.

[2] Berchmans H J, Hirata S.Biodiesel production from crude Jatropha curcas L.seed oil with a high content of free fatty acids[J].Bioresour Technol, 2008, 99： 1716-1721.

[3] Augustus G D P S, Jayabalan M, Seiler G J.Evaluation and bioinduction of energy components of Jatropha curcas[J].Biomass Bioenergy, 2002, 23： 161-164.

[4] Huang A H C.Oil bodies and oleosins in seeds[J].Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 1992, 43： 177-200.

[5] Murphy D J.Structure, function and biogenesis of storage lipid bodies and oleosins in plants[J].Prog.Lipid Res., 1993,32：247-280.

[6] Tzen J T C, Huang A H C.Surface structure and properties of plant seed oil bodies[J].J Cell Biol, 1992, 117： 327-335.

[7] Leprince O, van Aelst A C, Pritchard H W, et al.Oleosins prevent oil-body coalescence during seed imbibition as suggested by a low-temperature scanning electron microscope study of dessication-tolerant and -sensitive oilseeds[J].Planta, 1997, 204：109-119.

[8] Jiang P L, Wang C S, Hsu C M, et al.Stable oil bodies sheltered by a unique oleosin in lily pollen[J].Plant Cell Physiol, 2007, 48：812-821.

[9] Martinez-Herrera J, Siddhuraju P, Francis G, et al.Chemical composition, toxic/antimetabolic constituents, and effects of different treatments on their levels, in four provenances of Jatropha curcas L.from Mexico[J].Food Chem., 2006, 96：80-89.

[10] Iandolino A B, Dasilva F G, Lim H, et al.High quality RNA,cDNA, and derived EST libraries from Grapevine (Vitis vinifera L.)[J].Plant Mol.Biol.Rep., 2004, 22： 269-278.

[11] Gasic K, Hernandez A, Korban S S.RNA extraction from different apple tissues rich in polyphenols and polysaccharides for cDNA library construction[J].Plant Mol.Biol.Rep., 2004,22： 437a-437g.

[12] Ding L W, Sun Q Y, Wang Z Y, et al.Using silica particles to isolate total RNA from plant tissues recalcitrant to extraction in guanidine thiocyanate[J].Anal.Biochem., 2008, 374： 426-428.

[13] 林 莎,罗绍银,林 颖,等.从麻疯树胚乳中提取总RNA的快速方法[J].应用与环境生物学报, 2008, 14(5)： 692-694.

[14] Sangha J S, Gu K, Kaur J, et al.An improved method for RNA isolation and cDNA library construction from immature seeds of Jatropha curcas L.[J].BMC Res Notes, 2010, 3： 126-131.

[15] 丁 勇,刘 英,杨鸯鸯,等.油菜种子高质量总RNA提取的一种有效方法[J].华中农业大学学报, 2006, 25(5)： 465-468.

[16] Chen E C F, Tai S S K, Peng C C, et al.Identification of three novel unique proteins in seed oil bodies of sesame[J].Plant Cell Physiol, 1998, 39： 935-941.

[17] 丁 勇,陈庆波,徐春雷,等.油菜油体钙蛋白基因BnClo1的克隆和表达[J].作物学报,2008,34(11)： 1921-1928.

Study on methods of total RNA isolation from seeds of Jatropha curcas L.

DING Yong, FAN Hong-bo, ZHANG Gao-lei, YAN Yu-ting, LI Rui-yang
(Key Laboratory of Southwest Mountain Forest Resources Conservation and Utilization, Ministry of Education,Southwest Forestry University, Kunming 650224, Yunnan, China )

The total RNA from the seeds of Jatropha curcas L.was extracted by using RNAiso Plus method, RNApure Plant Kit method and improved CTAB method, in order to screen out extraction methods of isolating high quality total RNA from the seeds of Jatropha curcas L.The quality of total RNA was examined through OD value and formaldehyde denaturalization agarose gel electrophoresis, the purity and yield of the total RNA were examined by ultraviolet spectrophotometry.The results show that the RNA obtained from the seeds of Jatropha curcas L.with RNAiso Plus method had high purity, quality and yield.The brightness of 28S rRNA was twice of the band of 18S rRNA.The ratio of A260/A280 was 2.030.It was proved that total RNA was intact without degradation and pure without pollution.A partial cDNA with 603 bp length of oleosin gene from Jatropha curcas L.was cloned by RT-PCR with RNA as templates obtained by RNAiso Plus method.The results show that the RNA obtained from the seeds of Jatropha curcas L.with RNAiso Plus method, but not RNApure Plant Kit method and improved CTAB method, had high purity and quality and could be used in molecular biological research, like RT-PCR, RACE-PCR and full-length cDNA cloning directly.

Jatropha (Jatropha curcas L.); seeds; RNA extraction; RT-PCR

S793.2

A

1673-923X(2012)03-0158-04

2011-12-20

云南省教育厅科学研究基金项目(2010Y295)

丁 勇(1979— )，男，安徽霍邱人，硕士，讲师，主要从事林木生物技术方面研究；E-mail：dingyong@swfu.edu.cn

[本文编校：欧阳钦]