以红三叶鲜青草预加工废水发酵培养苏云金芽孢杆菌

曾家豫，赵静，孔维宝，刘雄雄，武伟国，葸玉琴，杨红

(西北师范大学生命科学学院，甘肃 兰州，730070)

红三叶草(红三叶，T.pratense)又名“红车轴草”、“红荷兰翘摇”，属多年生草本植物［1］，分布于欧洲、美国及新西兰，中国淮河以南亦有栽培。红三叶草是畜禽的优质饲料，产草量高，可用于发展畜牧业。含有多种异黄酮类物质，占其干重的0.5% ～3.5%［2］，高于其他豆类10～30倍。红三叶草及其制剂具有防治乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和改善骨质疏松［3-4］、以及女性更年期症状等作用［5-6］，是极有前途的天然保健食品［7］。

红三叶鲜青草预加工废水是为了提取红三叶草中的异黄酮类物质［8-9］，将新鲜的红三叶草通过一系列机械挤压和清洗等操作而加工成红三叶草干草的过程中产生的废水，目前，这些废水大多直接排放，不仅污染环境，而且浪费资源。因此，如何对其进行净化处理和有效利用成为亟待解决的问题。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)制剂是当前应用最广、最有效的微生物杀虫剂［10］。Berliner［11］于1911年首先从德国地带的一批被感染的地中海粉螟中分离得到该菌，属于革兰氏阳性土壤杆菌，在芽孢形成过程中产生称为δ-内毒素的杀虫伴孢晶体蛋白，具有很高的杀虫活性［12-13］。同时，研究人员发现，其在芽孢形成前的营养生长阶段，可分泌另外一种非δ-内毒素的杀虫蛋白，即Vip蛋白(vegetative insecticidal protein)，它是很有应用前景的杀虫蛋白，被称为第二代杀虫蛋白［14-15］。

本文以红三叶鲜青草预加工废水为原料，制备苏云金芽孢杆菌发酵培养基，发酵培养苏云金芽孢杆菌。以期探索研究一种红三叶鲜青草预加工废水净化处理和资源化利用的新方法。

1 材料、试剂与仪器

1.1 材料与试剂

红三叶鲜青草预加工废水，取自甘肃岷县方正草业开发有限公司。

ACCC01607-苏云芽孢杆菌(Bt)，购于广东微生物所菌种保藏中心;牛肉膏，酵母粉，蛋白胨，琼脂;葡萄糖、NaCl、K2HPO4、MnSO4·H2O、CaCO3等，均为分析纯试剂。

1.2 培养基

琼脂培养基:蛋白胨 5 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、琼脂20 g，用蒸馏水定容至1 000 mL，调节pH 7.0～7.2，121℃灭菌15 min，储存备用。

种子液体培养基:蛋白胨5 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g，用预处理后的红三叶草废水作为溶剂定容至1 000 mL，调节pH 7.0～7.2，121℃灭菌15 min，储存备用。

基础培养基:预处理后的红三叶草预加工废水，调节起始pH 7.0～7.2，121℃灭菌15 min，储存备用。

发酵培养基:由预处理后的红三叶草预加工废水，按不同比例补加(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4和CaCl2等营养成分。

1.3 仪器

U-1800型紫外可见分光光度计，日产日立;TGL-5000B低温冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂;HHS-2数显恒温水浴锅，国华电器有限公司;pH计，Thermo Orion;BS224S电子天平，北京赛多利斯天平有限公司;XD电热恒温干燥箱，天津市实验仪器厂;凯氏定氮仪(KDY-9810型)。

2 方法

2.1 红三叶草鲜青草预加工废水的处理

取红三叶草加工废水2 000 mL过滤，滤液于120℃加热处理10 min，冷却至室温，静置3 h，3 000 r/min离心5 min，得上清液，即可作为微生物基础发酵培养基，或作为培养基基液补加营养成分后制备微生物发酵培养基。

2.2 菌种活化和保藏

在无菌条件下，取少量菌种干粉，于1 mL无菌水中浸泡15 min，涂平板于琼脂培养基上，30℃下培养48 h。储存于4℃冰箱待用，每3～6个月转接1次。

2.3 种子液的培养

在250 mL锥形瓶中，加入100 mL种子液体培养基，接种1～2环活化的菌株，120 r/min，30℃下摇瓶培养24 h。

2.4 苏云金芽孢杆菌的发酵培养

在1000 mL发酵培养基中，接种一定量种子液后，于120 r/min，30℃下摇床培养48 h。在每一组实验中，发酵培养基配方和培养条件依具体实验设计而变化。

2.5 苏云金芽孢杆菌发酵条件的优化

采用Plackett-Burman［16］实验筛选影响苏云金芽孢杆菌发酵的主要因素;根据各主要因素的效应大小确定它们的变化方向及步长，设计最陡爬坡实验，确定苏云金芽孢杆菌发酵的最优条件所在区域的中心点;根据最优条件所在区域的中心点，设计Box-Benknken实验，并对其结果进行响应面分析，确定苏云金芽孢杆菌的最佳发酵培养条件。

2.6 分析检测方法

蛋白含量的测定:采用凯氏定氮法［17］测定。

总糖含量的测定:采用蒽酮比色法［18］测定。

Bt生物量的测定:通过差量法测定干细胞的重量。取5 mL发酵液于5 000 r/min离心20 min，弃去上清液，沉淀物用蒸馏水冲洗2～3次，再离心后于105℃下烘干至恒重。以未发酵的培养基作为对照，操作方法相同。

实验设计与数据分析:采用 Design-expert7.0(STAT-EASE inc.，Minneapolics，USA)软件设计实验并分析实验数据，统计参数以标准方差来评价。

3 结果与分析

3.1 红三叶鲜青草预加工废水的处理

检测结果显示(表1):基础发酵培养基(上清液)中，蛋白质含量为 0.437 g/L，总糖的含量为0.129 g/L，可基本满足Bt生长所需的碳源和氮源要求。另外，该发酵培养基为红三叶鲜青草在预加工过程中经挤压和清洗等操作而产生的水溶液，其中还含有色素、维生素和无机盐等成分，可作为Bt生长的营养物质。

表1 原废水和废水上清液的主要组成 g/L

3.2 影响苏云金芽孢杆菌发酵主要因素的筛选

以9个因素为评价对象，每个因素取高(+1)和低(-1)2个水平，9个因素间的组合共12组实验，Plackett-Burman(PBD)实验设计及结果见表2。以一阶模拟方程来评价9个因素的作用效果。一阶回归方程为:

表2 Plackett-Burman设计及结果

其中，Y代表预测响应值，β0和βi代表线性系数，xi代表单个因子。PBD实验拟合的一阶回归方程为:

Y=4.39+0.80X1+0.26X2+0.19X3-0.43X4+0.37X5+0.94X6-0.33X7+1.19X8+0.047X9

其中，Y—Bt生物量(g/L);X1-(NH4)2SO4(g/L);X2-KH2PO4(g/L);X3-MgSO4(g/L);X4-CaCl2(g/L);X5-MnSO4(g/L);X6-起始pH;X7-温度(℃);X8-发酵时间(h);X9-接种量［%(V/V)］。

在一阶模拟方程中，相关系数R2为0.979 6，接近98%，因而可用此一阶回归方程来解释响应值随各个因素的变化。

PBD实验结果的方差分析如表3所示。发酵时间、起始pH和(NH4)2SO4浓度对应的P值均小于0.05，因此它们是影响Bt生物量的主要因素。

表3 一阶回归方程方差分析

3.3 影响苏云金芽孢杆菌发酵主要因素最佳值所在区域中心点的确定

在PBD实验的基础上，用最陡爬坡设计(SAD)来确定3个主要因素的变化方向对Bt生物量生成的影响以及它们的最佳值所在区域的中心点，SAD实验设计和结果如表4所示。由表4可知，当发酵时间72 h、起始pH 7.0和(NH4)2SO4浓度为3.0 g/L时，Bt生物量最大(8.34 g/L)，表明此条件已接近于最优。

表4 最陡爬坡实验设计和结果

3.4 苏云金芽孢杆菌发酵最优条件的确定

在最陡爬坡实验的基础上，用Box-Behnken设计(BBD)确定3个主要因素的最优水平。每个因素设计5个水平(-1.682，-1，0，+1，+1.682)，3 个主要因素间的组合共20组实验，实验设计和结果如表5和表6所示。以二阶模拟方程来评价3个主要因素的作用效果。二阶回归方程为:

Y= β0+∑βixi+∑βiixi2+∑βijxiyi

其中，Y代表预测响应值，xi和yi代表单个因子，β0和βi代表线性系数，βii和βij代表二阶回归系数。BBD实验拟合的二阶回归方程为:

Y=8.42+0.13A+0.27B+0.52C－0.056AB－0.034AC+0.14BC－0.78A2－0.44B2－0.71C2

其中，Y—Bt生物量(g/L);A-发酵时间(h);B-起始pH;C-(NH4)2SO4浓度(g/L)。

在二阶模拟方程中，相关系数R2为0.9572。通常，R2＞0.9000就表明实验结果有很高的相关性，所以，此R2值反映实验值和预测值间有很好的拟合，用该二阶回归方程描述响应值随主要因素的变化趋势是合理的。

表5 Box-Behnken设计因素水平表

表6 Box-Behnken设计及结果

BBD实验结果的方差分析如表7所示。该模型对应的P值小于0.05，表明用该模型描述3个主要因素与Bt生物量间的相关性是显著的。

表7 二阶回归方程方差分析

最后，用三维响应曲线来解释各变量之间的相互作用并确定当响应值达到最大时各因素的最优水平，三维响应曲线如图1～图3所示。每个图表示其它因素处于固定值时3个主要变量中任意2个之间的相互作用对Bt生物量生成的影响。结果表明，当发酵时间为66.71 h，起始pH为7.36和(NH4)2SO4浓度为3.08 g/L时，Bt生物量达到最大值8.57 g/L。

图1 发酵时间和起始pH间相互作用对Bt生物量生成的响应曲线

3.5 最优条件的验证实验

通过上述实验优化了利用红三叶鲜青草预加工废水培养Bt的最佳条件:起始pH为7.36，发酵时间为66.71 h，温度为30℃，接种量为7.5%(v/v)，(NH4)2SO4浓度为 3.08 g/L，KH2PO41.0 g/L，Mg-SO40.25 g/L，CaCl20.15 g/L，MnSO40.5 g/L。为了确定该研究结果是否准确，在3 L发酵罐中于最优条件下发酵培养Bt。结果显示，所得Bt生物量的平均值为8.57 g/L，与实验预测值(8.42 g/L)相吻合。这表明响应模型基本准确。

图2 发酵时间和(NH4)2SO4浓度间相互作用对Bt生物量生成的响应曲线

图3 起始pH和(NH4)2SO4浓度间相互作用对Bt生物量生成的响应曲线

图4 最优条件下Bt生长曲线和发酵液pH变化

图4 为最优培养条件下Bt的生长曲线和发酵液pH值的变化情况。由图4可知，在0～72 h时，随着发酵时间的延长，发酵液pH逐渐增加;发酵时间超过72 h后，发酵液pH保持在8.5左右。随着发酵时间的延长，Bt生物量逐渐增加，到72 h左右时达到最大值。

4 结论

采用响应面优化法可快速筛选以红三叶草加工废水为原料培养Bt时影响生物量生成的显著因素，并通过建立多项数学模型，采用统计分析对模型进行显著性检验来优化发酵条件。结果表明，最佳发酵条件为起始pH为7.36，发酵时间为66.71 h，温度为30℃，接种量为7.5%(V/V)，(NH4)2SO4浓度3.08 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO40.25 g/L，CaCl20.15 g/L，MnSO40.5 g/L，在此最优条件下，Bt生物量可达到8.57 g/L，是以基础发酵培养基产生生物量的1.2倍。因此，可利用红三叶鲜青草预加工废水为原料培养Bt，达到了废物处理和合理利用资源的目的。

［1］ Figueiredo R，Rodrigues A I，do Céu Costa.Volatile composition of red clover(Trifolium pratense L.)forages in Portugal:The influence of ripening stage and ensilage［J］.Food Chemistry，2007，104(4):1 445-1 453.

［2］ 孙庆亮.红三叶［J］.北京农业，2001，3(1):31-31.

［3］ Almora K，Pino J A，Hernández M，et al.Evaluation of volatiles from ripening papaya(Carica papaya L.，var.Maradol roja)［J］.Food Chemistry，2004，86(1):127-130.

［4］ Alves C，Pio C，Duarte A.Composition of extractable organic matter of air particles from rural and urban Portuguese areas［J］.Atmospheric Environment，2001，35(32):5 485-5 496.

［5］ Kelly，Edmund G.Methods of cholesterol reduction using isoflavones［P］.United States Patent，2004，0305782A1.

［6］ Van de Weijer P H M，Barentsen R.Isoflavones from red clover(promensil)significantly reduce menopausal hot flush symptoms compared with placebo［J］.Maturitas，2002，42(3):187-193.

［7］ 于立娜，张永忠，辛禹.红三叶草异黄酮在保健食品和医药中应用的研究进展［J］.氨基酸和生物资源，2005，27(4):65-68.

［8］ Broderick G A，Albrecht K A，Owens V N，et al.Genetic variation in red clover for rumen protein degradability［J］.Animal Feed Science and Technology，2004，113(1-4):157-167.

［9］ Buttery R G，Kamm J A，Ling L C.Volatile components of red clover leaves，flowers，and seed pods:Possible insect attractants［J］.Agricultural and Food Chemistry，1984，32(2):254-256.

［10］ 鲁松清，孙明，喻子牛.苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因的分类［J］.生物工程进展，1998，18(5):57-59.

［11］ 史丽，白海艳，王瑞君，等.苏云金杆菌在温室蔬菜害虫防治中的应用［J］.内蒙古师范大学学报:自然科学版，2003，32(2):153-156.

［12］ Gill S S，Cowles E A，Pietrantonio P V，et al.The mode of Bacillus thuringiensis endotoxins［J］.Annu Rev Entomol，1992，37:615-634.

［13］ 孙明，喻子牛.苏云金芽孢杆菌中华亚种CT-43菌株伴胞晶体蛋白的特性［J］.微生物学报，1996，36(4):303-306.

［14］ 关雄.苏云金芽胞杆菌研究回顾与展望［J］.中国农业科技导报，2006，8(6):5-11.

［15］ Estruch J J，Warren G W，Mullins M A，et al.Vip3A，a novel Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with a wide spectrum of activities against lepidoteran insects［J］.Pro Natl Acad Sci USA，1996，93(11):5 389-5 394.

［16］ Wang J C，Wu C F J.A hidden projection property of plackett-burman and related designs［J］.Statistica Sinica，1995(5):235-250.

［17］ 戴宏林，吴小骏.用凯氏定氮法测定植物干样中的氮含量［J］.江苏农学院学报，1995，16(3):70-70.

［18］ 文赤夫，董爱文，李国章，等.蒽酮比色法测定紫花地丁中总糖及还原糖含量［J］.现代食品科技，2005，21(3):122-123.