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Sirt1和P55PIK 在胃癌中的表达及临床意义

2012-12-23王敬涛陶德定李小兰胡俊波龚建平

关键词:乙酰化切片胃癌

张 波, 王敬涛, 闵 江, 陶德定, 李小兰, 胡俊波, 龚建平, 严 群

华中科技大学同济医学院附属同济医院胃肠外科中心,武汉 430030

在世界范围内胃癌居癌症发病率的第4位,全球每年因胃癌死亡约80万人,其中中国占35%,是胃癌发病率和死亡率最高的国家之一。由于该病不易早期发现,且临床病情进展迅速,因此已引起人们的高度重视。

Sirt1是Ⅲ型组蛋白去乙酰化酶之一,在体内可将组蛋白及多种非组蛋白去乙酰化,调节基因表达及蛋白质功能[1-2]。研究发现,Sirt1 可以促进肿瘤形成,主要通过去乙酰基作用,抑制了如p53[3]、NFκB[4]等的凋亡调节作用。P55PIK 是PI3Ks(Phosphoinositide 3-kinases)的一个调节亚基。P55PIK可与视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma,Rb)蛋白特异性结合并参与Rb蛋白对细胞周期的调控[5]。有研究发现,抑制P55PIK 的功能能够抑制胃癌、肝癌和甲状腺癌等肿瘤的生长。

本研究采用免疫组织化学技术和蛋白印迹技术检测Sirt1和P55PIK 在胃癌组织和癌旁正常组织中的表达水平,旨在分析其与胃癌临床病理参数的关系,明确Sirt1和P55PIK 在胃癌发生发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2010年~2012 年华中科技大学同济医学院附属同济医院胃肠外科手术切除的45 例胃癌标本,全部病例均有完整的临床病理资料。其中男性27例,女性18例,患者平均年龄53.4岁。有淋巴结转移者32 例,无淋巴结转移者13 例。TNM 分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分别7、8、19、11 例(参照2010年NCCN 胃癌分期标准)。所有患者术前均未接受化疗、放疗和免疫治疗等。同时取此45例患者癌旁正常胃组织(距肿瘤边界5cm 以上)作为对照。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学检测 组织切片置于68℃下脱蜡3 min,随后以二甲苯溶液Ⅰ、Ⅱ各浸泡10 min。依次以100%、95%、75%的乙醇漂洗水化,每次各5min,以ddH2O 冲刷至无二甲苯气味,TBST平衡10 min。切片置于3%H2O2孵育15 min,ddH2O 冲刷,TBST 平衡5min,阻断内源性过氧化物酶。切片置于pH 6.0沸腾枸橼酸钠缓冲液中20 min。Blocking Solution室温封闭30min,分别加入兔源性Sirt1 抗体(Cell Signaling 公司,1∶100 稀释)和羊源性P55PIK 抗体(Santa Cruz公司,1∶100稀释)4℃过夜。将切片放于流水容器中振荡20次,再放入TBST 中振荡20次,平衡5min。TBST稀释二抗,室温孵育30min。将切片放于TBST 中振荡20次,平衡5min。DAB显色6min,避光。自来水冲洗。苏木精染色3~4 min,自来水冲洗。1%盐酸乙醇分化,浸一下至切片变蓝即可,清水冲洗。1%氨水返蓝,看到切片变蓝即可,清水冲洗。切片以盖玻片密封脱水。

1.2.2 免疫组化结果分析 Sirt1评分依据半定量IRS方法,评分结果由染色深度与镜下染色面积比例相乘得到。在高倍视野下,①按肿瘤细胞显色的比例评分,<25%为0分,25%~50%为1分,51%~75%为2分,>75%为3分;②按肿瘤细胞着色强度评分,无着色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分,每例最终评分等于①×②。最终结果0~3分为阴性,≥4分为阳性。

1.2.3 Western blot检测 随机选取15例胃癌患者手术切除标本的肿瘤组织及癌旁正常组织。将组织置于液氮中冷冻,后迅速放于研钵中研磨成粉末状,移置EP管中,加入含有蛋白酶抑制剂的裂解液(RIPA),置于冰上,超声波振荡3次,每次10s,后冰上静置10min。置于低温高速离心机12 000r/min,4℃,离心10min,取上清,以BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。加入溴酚蓝后放入100℃,5min变性。制备10%聚丙烯酰胺凝胶,取等量样品上样于聚丙烯酰胺凝胶,电泳(60 V,30 min;120V,130min),至溴酚蓝跑到胶底部。将聚丙烯酰胺凝胶经过转膜仪转至0.45μm PVDF膜上,用5%的脱脂牛奶封闭该PVDF 膜60 min,以TBST 溶液洗膜3 次,以1%BSA 溶液1∶1 000稀释兔源Sirt1抗体(Cell Signaling公司),1∶500 稀释羊源P55PIK 抗体(Santa Cruz公司),封闭相应蛋白条带,置摇床4℃过夜。用TBST 振荡洗涤膜4次,10 min/次,以5%脱脂牛奶1∶2 000 稀释HPR 标记的兔羊二抗,常温摇床上孵育PVDF膜,120min后以TBST 彻底洗涤膜6 次,10 min/次。加入显色液(Thermo公司)于凝胶成像系统中曝光。

1.3 统计学分析

采用SPSS 12.0分析软件进行统计分析。计数资料采用χ2检验分析,相关性采用Spearman相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Sirt1和P55PIK 蛋白的表达情况

Sirt1和P55PIK 主要定位于细胞核,故其阳性着色细胞,细胞核呈黄色或棕黄色,且不同病理切片染色深度不同,根据肿瘤细胞着色强度评分列出不同染色深度的图像(见图1)。45例胃癌及癌旁正常组织中Sirt1阳性表达率分别为55.56%(25/45)和24.44%(11/45),两组间差异具有统计学意义(P<0.05)。45例胃癌及癌旁正常组织中P55PIK 阳性表达率分别为64.44%(29/45)和35.56%(16/45),两组间差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.2 Sirt1和P55PIK 表达与胃癌临床病理特点之间的关系

45例胃癌组织中,Sirt1及P55PIK 蛋白表达与患者性别、年龄、肿瘤直径及浸润深度无明显相关性(P>0.05),而与胃癌TNM 分期和淋巴结转移有关(见表1)。有淋巴结转移者Sirt1、P55PIK 蛋白阳性表达率较无淋巴结转移者高(P<0.05),Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者之间Sirt1、P55PIK 蛋白表达差异具有统计学差异(P<0.05)。

图1 Sirt1和P55PIK 免疫组化着色强度评分(SP,×200)Fig.1 Immunohistochemistry of Sirt and P55PIK expression(SP,×200)

2.3 Western blot检测Sirt1和P55PIK 的表达

随机选取15例胃癌患者手术标本肿瘤组织及癌旁正常组织,提取组织蛋白行Western blot检测(图2),结果显示在15 例患者中有9 例患者Sirt1在胃癌组织中的表达高于癌旁组织,所占比例为60.0%;有10例患者P55PIK 在胃癌组织中的表达高于癌旁组织,所占比例为66.67%;有8例患者的Sirt1和P55PIK 在胃癌组织中的表达均高于癌旁组织,所占比例为53.33%,这说明Sirt1和P55PIK在肿瘤组织蛋白中的表达具有相关性。通过灰度分析得出(图3),15例患者中Sirt1和P55PIK 在胃癌组织中的平均灰度值明显高于癌旁正常组织。

图2 15例患者中Sirt1和P55PIK 的蛋白表达水平Fig.2 The protein expression level of Sirt1and P55PIK in 15patients

表1 Sirt1和P55PIK 在胃癌中的表达与临床病理特点之间的关系Table 1 Correlations of Sirt1and P55PIK expression to clinicopathologic features of gastric cancer

图3 15例患者Sirt1和P55PIK 蛋白表达水平的比较Fig.3 The gray values of Sirt1and P55PIK protein expression levels in 15patients

2.4 胃癌组织中Sirt1、P55PIK 表达相关性

在45例胃癌组织中,25例Sirt1表达阳性者中20例P55PIK 表达阳性,20例Sirt1表达阴性者中11例P55PIK 表达阴性,根据Spearman相关性分析得出两者在胃癌组织中表达呈正相关(χ2=5.940,r=0.363,P=0.015)。

3 讨论

Sirt1是Ⅲ型去乙酰化组蛋白中的一员,与酵母菌中的sir2是同源物。Sirt1在限制能量摄入过程中被激活,与延长细胞寿命有关系[1]。但在Sirt1与肿瘤关系的研究中,其作用尚未得到统一的认识。研究发现,Sirt1通过组蛋白修饰增加基因组的稳定性,通过与Bax,Bcl2蛋白家族相联系影响着细胞周期进展[2]。在人体内Sirt1 能够结合并去乙酰化p53蛋白[6],而这种结合对p53 蛋白的去乙酰化改变及对p53作为一个重要转录因子的功能产生了巨大影响,直接影响了p53的抑癌功能[7]。同时Sirt1通过与Bax、NF-κB、Ku、E2F1、FOXO 等凋亡蛋白的直接结合而使细胞寿命延长,并且诱导NBS1蛋白去乙酰化,调节细胞DNA 损伤信号通路,使得细胞寿命延长,从而促进肿瘤的发生。在对多种体外培养细胞应用Sirt1激活物后都可以观察到细胞平均寿命延长[8],相反,当通过RNAi技术抑制Sirt1蛋白表达后,可以明显观察到细胞周期阻滞和细胞凋亡。在高表达Sirt1的转基因老鼠中,由于ApcMin的突变而使得肠癌的发生减少,并且Sirt1可使βcatenin去乙酰化,从而抑制肿瘤细胞的增殖,这表明Sirt1尚有抑制肿瘤生长的功能。

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)是连接细胞外信号和细胞内信号的重要信号分子,在细胞的增殖、凋亡、分化、物质代谢中发挥重要功能[9-10]。P55PIK是PI3Ks的一个调节亚基。P55PIK 可与视网膜母细胞瘤蛋白(Retinoblastoma,Rb)特异性结合并参与Rb 蛋白对细胞周期的调控[5]。有报道称P55PIK 在卵巢癌中表达显著升高,下调P55PIK 的表达可抑制卵巢癌细胞的增殖。有研究进一步发现,抑制P55PIK 的功能能够抑制胃癌、肝癌和甲状腺癌等肿瘤的生长[11-12]。同时抑制P55PIK 的功能能够有效抑制胃癌细胞的增殖和迁移[13]。这些研究结论均提示P55PIK 在肿瘤的发生发展中有重要功能。

在肿瘤的发生过程中PI3K 和Sirt1在促进肿瘤细胞的增殖、转移和抑制凋亡中都发挥着重要作用,P55PIK 作为PI3Ks的一个重要的调节亚基,在肿瘤发生发展中同样发挥着重要的作用。在细胞中PI3Ks信号通路可调节Sirt1的表达[14],使其发挥不同的作用,那作为PI3Ks信号通路重要的调节亚基的P55PIK 是否也参与Sirt1的调节,目前还没有相关实验结果证实。根据我们实验室前期研究结果,免疫共沉淀显示Sirt1和P55PIK 在细胞中存在相互作用。本实验旨在通过检测临床肿瘤标本中Sirt1和P55PIK 的表达水平,分析两者之间是否存在相关性。本实验证明Sirt1和P55PIK 在胃癌组织中明显高表达,且跟胃癌TNM 分期和淋巴结转移有关。在胃癌组织中两者存在共表达现象,且表达强度呈正相关性,推测两者协同作用对肿瘤的发生发展有着重要的作用,联合检测可作为判断胃癌的预后和筛选高危转移患者的指标,并可作为有效的治疗靶点。

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