自噬活性改变对骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响＊

李 军， 王 倩， 林小星， 李炳宗

苏州大学附属第二医院血液科，苏州 215004

间充质干细胞（MSCs）存在于多种组织中，是具有多向分化潜能的早期前体细胞，在适当的条件或者环境下可以分化为某种细胞［1］。MSCs的两个重要的分化方向为骨细胞和脂肪细胞，成骨分化和成脂分化之间存在动态平衡［2］，众多分子机制参与此平衡的维持，然而确切的机制目前并不明确。

自噬是广泛存在于真核生物中的保守的代谢过程，在此过程中，胞内成分被降解，形成自噬小体，后者与溶酶体相结合形成自噬溶酶体［3］。目前关于自噬研究最深入的是关于其在细胞的生存或者死亡中的作用［4］。近来有研究发现，自噬在细胞和生物体的发育和分化过程中起重要作用，最早关于自噬在哺乳动物发育中的作用是在受精卵中观察到自噬现象［5］。另有研究发现，自噬参与血细胞、脂肪细胞、肝细胞、心肌细胞、骨骼肌肉细胞、胰岛β细胞、肾脏足细胞等多种终末分化细胞的发育和分化［6］。最近有研究证明自噬在干细胞分化中具有重要作用，如Zhao等［7］报道，自噬功能损害导致胶质瘤干细胞的分化障碍是胶质瘤发病原因之一。而自噬在MSCs的多向分化过程中的作用尚未见报道。

本研究中我们探讨骨髓MSCs的基础自噬活性，以及自噬活性改变对其向成骨细胞分化潜能的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料

Real－time PCR 引物由上海生工生物工程公司合成；逆转录和PCR 试剂盒购自大连TaKaRa公司；ECL化学发光试剂盒、LC3 和Beclin 1 抗体购自Santa Cruz公司；兔抗人GAPDH 单克隆抗体和辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG 抗体购自Abcam 公司；TrizolTMreagent核酸分离试剂盒、地塞米松、维生素C、单丹磺酰戊二胺（MDC）、DF－12和MCDB 培养液购自Sigma 公司；胎牛血清、ITS、青霉素和链霉素均购自Gibco公司；BD 公司FACS Vantage型流式细胞仪；Nikon TE 2000型荧光显微镜；Leica SP2 激光共聚焦显微镜；Bio－Rad icycler荧光实时定量PCR 仪。

1.2 MSCs的分离和培养

取截肢患者骨髓5～10mL，肝素抗凝。Ficoll－Paque分离骨髓单个核细胞，培养液为50% DF12、40% MCDB、10%胎牛血清、1×ITS、100U／mL 青霉素和100μg／mL 链霉素。置37℃、5%CO2饱和湿度培养箱，48h后去除悬液，每3～4d换液。细胞融合达80%时用0.125%胰蛋白酶和0.1%EDTA 按照1∶3消化传代。取第3代细胞进行实验。

1.3 自噬激活剂雷帕霉素处理MSCs后成骨诱导分化

MSCs培养体系中加入不同浓度的自噬激活剂雷帕霉素（10、50、100nmol／L），48h后换为成骨细胞诱导分化培养液（10%胎牛血清、0.1μmol／L 地塞米松、0.2mmol／L 抗坏血酸、10 mmol／Lβ甘油磷酸钠、100U／mL 青霉素和100μg／mL 链霉素），2周后检测自噬活性和成骨基因ALP 和Runx2表达，4周后Von Kossa染色法检测钙质沉积程度。

1.4 免疫荧光激光共聚焦法检测LC－3表达

PBS洗涤接种于多聚赖氨酸包被玻片上的MSCs，用－20℃预冷的甲醇固定10min；PBS洗涤后滴加1%BSA 封闭液封闭细胞；滴加LC3（1∶1 000稀释）一抗孵育，4℃过夜；PBS洗涤后滴加二抗避光孵育，4℃，1h；PBS洗涤后滴加荧光封裱液封片；共聚焦显微镜下观察并摄片。

1.5 MDC荧光染色检测自噬囊泡

用含MDC（50μmmol／L）的培养液孵育接种于多聚赖氨酸包被玻片上的MSCs，37℃、5%CO2、10 min；PBS洗涤后，用紫外线激发，于倒置荧光显微镜下观察并拍照。

1.6 Von Kossa染色

10%甲醛固定MSCs，1h后去离子水洗净，加入2%硝酸银溶液，37℃避光反应30min。去离子水洗净后曝光，光镜下观察并拍照。

1.7 实时定量PCR 检测

Trizol regeant提取MSCs总RNA，将逆转录后的cDNA 产物，以GAPDH 为管家基因，应用嵌入荧光染料SYBR Green Ⅰ进行荧光定量PCR 扩增。25μL扩增体系中含ROX 0.5μL，2×Premix 12.5μL，上游和下游引物各1μL，模板cDNA 1 μL。扩增条件为：95℃10s，95℃5s，60℃60s，40个循环。ALP引物为5′－ACCATTCCCACGT－CTTCACATTTG－3′（正义）和5′－AGACATTCTCTCGTTCACCGCC－3′（反义）；Runx2 引物为5′－CCCCACGACAACCGCACCAT－3′（正义）和5′－CACTCCGGCCCACAA ATC－3′（反义）；GAPDH的引物为5′－GTC TTCACCACCATGGAGAAGCT－3′（正义）和5′－CATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCA－3′（反义）。

1.8 Western blot检测

MSCs经预冷PBS洗涤后离心，按照每1×106个细胞加入60μL裂解液，超声裂解细胞，提取总蛋白，BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。调整各组上样量在20μg，SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后，50g／L 脱脂奶粉封闭，加入兔抗人LC3 抗体（1∶100）和GAPDH 抗体（1∶1 000）孵育过夜，加HRP标记羊抗兔IgG（1∶5 000）孵育1h。洗膜后，用ECL显色系统显示相应蛋白条带，照相。利用Glyko BandScan分析软件测定条带吸光度后统计。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 雷帕霉素促进LC3－Ⅰ向LC3－Ⅱ转化

雷帕霉素作为自噬激动剂，可以明显增加LC3－Ⅱ的表达量，并且此改变与雷帕霉素的剂量呈正比，见图1。说明雷帕霉素可以明显增加MSCs的自噬活性。

图1 雷帕霉素对MSCs的LC3表达的影响Fig.1 Effect of rapamycin on the expression of LC3in MSCs

2.2 雷帕霉素增加自噬囊泡数量

基础状态下MSCs自噬囊泡数量不多，但是随着雷帕霉素浓度的升高，自噬囊泡数量明显升高，见图2。也说明雷帕霉素能够增加MSCs自噬活性。

图2 雷帕霉素对MSCs自噬囊泡数量的影响（×200）Fig.2 Effect of rapamycin on the number of autophagic vacuoles in MSCs（×200）

2.3 雷帕霉素增加LC3数量

基础状态下MSCs胞质中可见少量LC3，但是在雷帕霉素作用后，LC3 表达明显增加，并呈剂量依赖性，见图3。再次证明雷帕霉素可以增加MSCs自噬活性。

图3 免疫荧光激光共聚焦法检测MSCs经不同浓度雷帕霉素处理后的LC－3表达（×200）Fig.3 Localization of LC3in MSCs after treatment with different concentrations of rapamycin detected by using immunocytochemistry（×200）

2.4 雷帕霉素减弱MSCs的成骨相关基因的表达

雷帕霉素处理后的MSCs其向成骨细胞分化的潜能降低，表现为成骨相关基因Runx2和ALP 的mRNA 表达在成骨培养2周后随着雷帕霉素浓度的增加而减少，见图4。

2.5 雷帕霉素减弱MSCs钙质沉积程度

不同浓度的雷帕霉素处理MSCs，4 周后Von Kossa染色检测其钙质沉积，结果显示雷帕霉素明显减弱MSCs向成骨细胞分化的能力，此改变与雷帕霉素的剂量呈反比，见图5。

图4 实时定量PCR 检测MSCs经不同浓度雷帕霉素处理后的ALP和Runx2mRNA 表达Fig.4 mRNA expression of ALP and Runx2in MSCs after treatment with different concentrations of rapamycin

图5 Von Kossa染色检测经不同浓度雷帕霉素处理后MSCs的钙质沉积程度（×100）Fig.5 Calcium deposit in MSCs after treatment with different concentrations of rapamycin（×100）

3 讨论

基于MSCs具有向成骨细胞分化的功能，因而来源于各种组织的MSCs被作为骨组织工程的重要细胞来源［8］，而由于骨髓MSCs取材简单，来源丰富，所以成为主要细胞来源。近些年来，越来越多的研究对MSCs向成骨细胞分化的机制和影响因素进行探讨［8－9］，但是确切机制目前尚未完全明确。

MSCs向成骨细胞分化分为3个阶段［10］，第一阶段为细胞增殖期，而第二阶段即第5～14 天为ALP 的转录和蛋白合成期，此后ALP 表达下降［11］，再后高表达骨钙蛋白和骨桥蛋白，并逐渐形成钙质沉积［12］。而Runx2是成骨的最重要的转录因子［13－14］，所以我们在成骨培养2周后检测ALP和Runx2的表达，第4周检测钙质沉积程度。无论是成骨基因检测还是钙质沉积检测均提示作为自噬激活剂的雷帕霉素能够减弱MSCs向成骨细胞分化的能力。

MSCs的自噬活性改变可能受到其周围细胞影响，Sanchez等［15］报道，利用去血清培养MSCs与MCF－7乳腺癌细胞共培养，模拟肿瘤组织核心缺氧环境下MSCs对肿瘤细胞的支持作用，结果发现MSCs的自噬活性明显升高，提示MSCs通过自噬来维持自身生存，同时对周围肿瘤细胞产生支持作用。此发现与我们在多发性骨髓瘤中的研究相符［16］，我们发现正常骨髓MSCs本身存在一定基础的自噬活性，而多发性骨髓瘤患者的骨髓MSCs自噬活性明显增加，所以MSCs是否在多发性骨髓瘤细胞的影响下自噬活性升高值得进一步探讨。

近些年来，自噬作为生物体内保守的生命现象，在细胞和器官的分化和发育过程中的作用备受关注。最初的相关资料主要见于神经系统相关研究中，自噬缺乏导致大脑和小脑皮质广泛的神经元缺失和神经退行性病变［17］。目前发现，自噬功能损伤抑制胶质瘤干细胞的分化［7］。Nakai等［18］研究发现，自噬对于心肌细胞的发育至关重要，自噬的缺失可能导致心肌肥厚、心脏扩大以及心功能不全。自噬对于胰腺β细胞的结构和功能的维持至关重要，自噬活性缺陷导致血糖明显升高［19］。肌肉纤维组织的结构和功能完整以及脂肪细胞分化和发育也和自噬关系密切［20－21］。自噬是造血细胞分化成熟过程中的重要过程，抑制自噬可能导致造血细胞的分化成熟障碍，表现为贫血和白细胞减少［22］。最近研究发现，自噬参与了慢性粒细胞性白血病K562细胞向巨核细胞的分化过程［23］。同时，自噬还与细胞凋亡有关［24－26］。在本研究中，我们发现利用自噬激动剂雷帕霉素促进MSCs的自噬活性后，其向成骨细胞分化的潜力减弱，说明MSCs的自噬活性与其向成骨细胞分化潜能之间存在密切联系。

综上所述，我们的研究发现自噬激活剂雷帕霉素可以增加骨髓MSCs的自噬活性，同时抑制其向成骨细胞分化中，初步证实自噬活性改变可能参与了MSCs向成骨细胞的分化过程。

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