小分子双链RNA 对人类细胞中抑癌基因p21表达的上调作用＊

胡 嘏， 陈 忠， 吴 嘉， 张 勇， 徐 华， 杨为民， 叶章群

华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科，武汉 430030

RNA 激活（RNAa）是新近发现的一种基因调节方式，小的双链RNA（dsRNA）通过靶向基因启动子区或反义转录本可以介导相应基因转录水平的激活［1－3］。这些具有RNAa功能的dsRNAs则被称为“小激活RNA”（saRNA），在细胞内发挥与RNA干扰（RNAi）相反的作用。利用RNAa靶向上调抑癌基因表达为肿瘤的基因治疗提供了更具前景的策略，前期研究中，我们针对抑癌基因p21WAF1／CIP1启动子区设计的saRNA（即dsP21－322），已在体外培养的前列腺癌、膀胱癌等细胞系中明显激活p21的表达，并抑制肿瘤细胞生长，促进凋亡［2，4］。本研究旨在筛选更多对dsP21－322起效应的新细胞系，同时在p21 被激活时检测其上游p53 的表达，对dsP21－322介导p21 的上调是否依赖p53 进行初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

化学合成的dsP21－322及dsControl（广州RiboBio公司），人肺腺癌细胞系NCI－H1299、人宫颈癌细胞系HeLa、人骨肉瘤细胞系U2－OS、人肾上皮细胞系293T（武汉大学中国典型培养物保藏中心），RPMI 1640和DMEM 培养液、胎牛血清（美国Hyclone公司），Entranster－R（北京英格恩生物公司），OPTI－MEM、Trizol Reagent、SuperScript reverse transcriptase、引物合成（美国Invitrogen 公司），RNase－free DNase Ⅰ（德国Qiagen 公司），SYBR Green Real Time PCR Master Mix（TaKaRa 公司），BCA protein assay kit（美国Pierce公司），一抗鼠单抗p53（美国CST 公司），一抗兔多抗p21和鼠单抗GAPDH（英国Abcam 公司），二抗HRP 标记羊抗兔／鼠、Western blotting Luminol（美国Santa Cruz公司）。

1.2 dsRNA 的设计

dsP21－322为针对p21基因启动子区相对转录起始点－322bp附近设计的与该段启动子互补配对，长度为21 个核苷酸碱基对的小激活RNA［2］。dsControl为已知缺少人类基因重要同源性，长度同样为21个核苷酸碱基对的dsRNA 序列，实验中作为阴性对照。

1.3 细胞培养及转染

NCI－H1299、U2－OS 及293T 细胞系生长在含10%胎牛血清的DMEM 培养液中，HeLa细胞系生长在含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养液中，37℃、5%CO2孵育箱培养。取对数生长期的细胞用于转染实验，转染试剂Entranster－R 被用于dsP21－322及dsControl的转染，以转染时细胞汇合度在40%为宜，用无血清培养液（OPTI－MEM）分别稀释dsRNA 和转染试剂Entranster－R，继而混合两者，室温静置30 min完成转染复合物的制备，将其加入6 孔板中，并补足培养液，使dsRNA的终浓度为50nmol／L，6h后观察细胞状态并更换培养液。

1.4 总RNA的提取及RT－qPCR 分析

转染后72h 收集细胞用于mRNA 表达的分析。总RNA 的提取使用Trizol Reagent，每个RNA 的样本用RNase－free DNaseⅠ处理以去除残余的DNA。利用SuperScript reverse transcriptase和oligo（dT）引物将1μg总RNA 合成cDNA。合成的cDNA 利用SYBR Green Real Time PCR Master Mix 及特异性引物通过qPCR 进行扩增。p53 的qPCR 引物序列为：上游引物5′－GTTCCGAGAGCTGAATGAGG－3′，下游引物5′－TCTGAGTCAGGCCCTTCTGT－3′；p21 的qPCR 引物序列为：上游引物5′－AGCAGCGGAACAAGGAGT－3′，下游引物5′－CGTTAGTGCCAGGAAAGACA－3′；18srRNA 作为内参基因也被扩增，qPCR 引物序列为上游引物：5′－GTAACCCGTTGAACCCCATT－3′，下游引物：5′－CCATCCAATCGGTAGTAGCG－3′。采用2－ΔΔCt方法分析基因相对定量表达。

1.5 总蛋白的提取及Western blot分析

转染后96h 收集细胞用于蛋白表达的分析。用PBS洗2次细胞，加入包含蛋白酶抑制剂Cocktail的细胞裂解液（50mmol／L Tris－HCl，pH 7.5，150 mmol／L NaCl，0.5% NP－40，2 mmol／L EDTA），4℃裂解30min，高速离心15min收集上清。使用BCA protein assay kit进行蛋白浓度的测定。将每个样本提取的蛋白上样20μg 至SDS－PAGE胶进行电泳，蛋白转移至NC 膜经含5% 脱脂奶粉的TBST 溶液室温封闭1h后，与特异性一抗鼠单抗p53（1∶200稀释）、兔多抗p21（1∶100稀释）及鼠单抗GAPDH（1∶500稀释）4℃孵育过夜。继而NC膜与HRP 标记羊抗兔／鼠的二抗（1∶3 000 稀释）孵育1h，通过Western blotting Luminol试剂观察免疫反应的条带，测定各条带的吸光度值。以各条带与GAPDH 吸光度值的相对值表示目的基因的蛋白表达量。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 dsP21－322对p53存在的肿瘤细胞系p21的调控

为筛选更多对dsP21－322起效应的细胞系，同时观察dsP21－322 介导p21 激活过程是否依赖p53的表达，我们首先选择p53存在的2种肿瘤细胞系，p53野生型（p53wild type）的人骨肉瘤细胞系U2－OS和p53突变型（p53 mutant type）的人宫颈癌细胞系HeLa作为研究对象，分别将阴性对照dsControl及dsP21－322 转染至上述细胞系，观察dsP21－322对p21 调控的影响。如图1A 和1C，转染72h 后RT－qPCR 检测显示，相比dsControl，dsP21－322均明显激活了上述2种细胞系p21基因的表达，分别上调3.97倍和4.94倍。Western blot检测也进一步明确p21蛋白水平在2种细胞系中的增加（图1B和1D），较dsControl分别增加（3.27±0.51）倍和（4.85±0.97）倍，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。同时我们检测了p53基因及蛋白的表达水平，结果显示dsP21－322的加入对p53的表达无明显影响，与dsControl相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 dsP21－322上调U2－OS（p53野生型）及HeLa（p53突变型）细胞系p21mRNA 及蛋白表达Fig.1 Up－regulation of the expression of p21mRNA and protein in U2－OS cell line（p53 wild type）and HeLa cell line（p53 mutant type）by dsP21－322

2.2 dsP21－322对p53缺失的肿瘤细胞系p21的调控

上述结果表明p53 存在时，dsP21－322 可以上调p21的表达水平，为进一步明确p53在此过程中的作用，我们将dsP21－322 转染至p53 缺失（p53 null）的人肺腺癌细胞系NCI－H1299，观察p21的表达情况。72h 后RT－qPCR 检测p21 基因表达水平，如图2A，相对dsControl，dsP21－322的加入并未明显激活p21基因的表达水平，转染后96h Western blot检测也未见p21蛋白水平的增加（图2B），较dsControl上调（0.27±0.64）倍，差异无统计学意义（P＞0.05）。上述结果表明dsP21－322在p53缺失的肿瘤细胞系未能激活p21的表达。

图2 dsP21－322 不能上调NCI－H1299（p53 缺失）细胞系p21 mRNA 及蛋白表达Fig.2 Effects of dsP21－322on the expression of p21mRNA and protein in NCI－H1299cell line（p53null）

2.3 dsP21－322对非肿瘤细胞系p21的调控

之前及以上研究表明，dsP21－322 在多个肿瘤细胞系中具有明显激活抑癌基因p21的能力，是否dsP21－322在非肿瘤细胞系中也能上调p21 的表达，我们选择p53野生型（p53wild type）的人肾上皮细胞系293T 进行研究。如图3A 及3B，相对ds－Control，转染dsP21－322后的293T 细胞系，p21基因和蛋白的表达也明显升高，p21mRNA 的表达上调4.64倍，蛋白上调（3.01±0.77）倍，差异具有统计学意义（P＜0.05），提示dsP21－322 在非肿瘤细胞系中同样具备上调p21 表达的能力。同期检测p53的表达水平与U2－OS及HeLa细胞系结果相同，与dsControl相比，增加（0.64±0.41）倍，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图3 dsP21－322上调293T（p53野生型）细胞系p21mRNA 及蛋白表达Fig.3 Up－regulation of the expression of p21mRNA and protein in 293Tcell line（p53wild type）by dsP21－322

3 讨论

众多研究表明，小分子RNA 在进化过程中已演化成一种通用的基因调控工具，10多年前研究发现的小分子双链RNA（dsRNA）进入细胞后能导致同源性基因表达沉寂，即RNA 干扰（RNAi）现象，目前已被广泛应用于基础研究及临床药物研发中［5－9］。新近的研究表明dsRNA 还可以上调基因表达，体现出其在基因组功能调控中的多样性。我们称这一现象为RNA 激活，简称RNAa。与RNAi相似，RNAa提供了快速高效改变基因表达的方式，利用RNAa可以上调沉寂的或低表达的活性基因，如肿瘤细胞中的抑癌基因。此外，RNAa过程伴随目的基因启动子区表观遗传的改变，致使上调基因持续的时间更持久［1－2］。这些特征使得RNAa成为肿瘤治疗的一种理想策略。p21WAF1／CIP1作为重要的细胞周期蛋白依赖激酶（CDK）抑制因子家族的成员，通常负性调控细胞周期进而抑制肿瘤进展。在临床上p21的缺失或失活常见于原发的实体肿瘤，并且与这些肿瘤的进展及较差的预后相联系［10－11］。因此p21可以作为RNAa治疗肿瘤的理想靶点。

前期针对p21 基因启动子设计的saRNA（dsP21－322）能在前列腺癌、膀胱癌等细胞系中明显激活p21表达，并且上调的p21表现出相应的生物学活性。本研究又证实dsP21－322在骨肉瘤及宫颈癌等实体肿瘤细胞系及正常的肾上皮细胞系中激活p21的表达，显示出RNAa现象在人类细胞中的普遍性。已有多篇文献报道，p21基因的表达与骨肉瘤及宫颈癌等肿瘤的治疗研究密切相关。Kim等［12］研究在U2－OS细胞中，莱菔硫烷（一种化学抗肿瘤复合物）通过上调p21表达促使细胞周期发生阻滞，并诱导凋亡。Maritz等［13］报道转录因子AP－1阻碍p21在宫颈癌细胞的表达，当抑制AP－1表达时，上调的p21可以抑制细胞增殖。相比上述研究，RNAa方法更直接，通过靶向p21启动子区来激活p21表达，从而达到治疗相应肿瘤的目的。最近已有利用dsP21－322在体内研究的相关报道，如Wei等［14］利用dsP21－322体内实验激活p21 在肺癌细胞的表达，抑制了肿瘤的生长，并且上调的p21还增强了癌细胞对顺铂治疗的敏感性。另外p21 在293T 细胞系的激活表明RNAa不应局限于肿瘤的治疗研究，还可以在实验研究中作为各种传统的载体过表达系统的替代者。

当然RNAa也体现出其基因调控方式的复杂性，如转录因子p53是否参与RNAa过程调控其下游靶基因p21 表达尚不明确。正常p53 基因，即野生型p53 作为人类肿瘤相关性最高的基因，编码转录因子p53 蛋白，在细胞受到生长刺激或发生转化时，表达迅速增加，并引起其下游p21的表达相应上调［15］。本研究在p53 突变型宫颈癌HeLa 细胞系中，观察到dsP21－322可以明显激活p21的表达，表明这一过程可能不依赖p53的表达。而在p53野生型骨肉瘤细胞系U2－OS 及肾上皮细胞系293T，dsP21－322具备上调p21 表达的能力，但在p53 缺陷型肺腺癌细胞系NCI－H1299，则未能观察此现象。因此dsP21－322介导p21表达是否依赖p53的参与需要进一步证实。此外，对p53 野生型的细胞系，Laptenko等［16］新近研究发现p53 可以与其在p21启动子区的反应元件结合，完成对p21 的转录调控。本研究在野生型p53的细胞系观察到p21被激活同时并未见p53表达增加，是否dsP21－322通过招募更多p53作用于p21的启动子完成p21的转录调控还需进一步研究。目前我们已经观察到类似的现象，在对AGO2蛋白如何参与dsP21－322介导p21表达上调的研究中发现，dsP21－322的加入并不改变AGO2蛋白的表达，而是增加了其在p21启动子区的聚集［17］。我们在下一步研究中还会利用RNAi沉默p53 的表达来明确其在该过程中对p21的调控作用。

尽管对saRNA 介导p21激活的机制仍不完全清楚，如没有明确其分子靶点及哪些蛋白质参与该过程。但是saRNA 对多个人类细胞产生效应仍体现出很好的应用前景，相信随着对RNAa机制研究的不断深入，利用RNAa特异性激活沉寂的抑癌基因或其他失调基因，将会促进以dsRNA 为基础的药物靶向治疗肿瘤及其他疾病的潜能。

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