绿脓杆菌制剂对人肝癌细胞株BEL-7402的杀伤效应

郭林娜

齐齐哈尔医学院解剖教研室，黑龙江齐齐哈尔 161006

绿脓杆菌制剂（PA-MSHA）是用绿脓杆菌（甘露糖敏感性）菌毛株经过培养、灭活、纯化后磷酸盐（PBS）缓冲液稀释而成，其有效的药理部位在于甘露糖结合蛋白的菌毛，能特异性地与高甘露糖表达型的肿瘤细胞结合，诱导肿瘤细胞凋亡[1]。以往研究表明PA-MSHA改善人体的免疫状况、对恶性肿瘤有辅助治疗的作用[2-3]。本研究主要观察PA-MSHA对肝细胞癌的体外杀伤作用，为进一步研究杀伤机制提供依据，找到治疗肝癌的新药。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

人肝癌细胞BEL-7402由哈医大一院中心实验室提供。RPMI-1640培养基为美国Promega公司生产，使用前加小牛血清至10%，青霉素、链霉素至100 U/mL。酶联免疫检测仪（Safie2型）奥地利公司。透射电镜（EM208S）荷兰菲利普公司。

1.2 实验方法

1.2.1 药物处理及分组 PA-MSHA原液浓度为10×107/mL，将其生理盐水稀释成10×107/mL、5×107/mL、2.5×107/mL、1.25×107/mL、0.631×107/mL、0.31×107/mL浓度组，稀释倍数为两倍，将各组稀释的药物作为MTT比色实验的实验组，其中5×107/mL、2.5×107/mL两组与肝癌细胞作用后，观察两组肝癌细胞形态学变化观察，各实验组药物均用生理盐水稀释。

1.2.2 细胞培养 将复苏后的肝癌细胞BEL-7402接种于在37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，培养液RPMI1640含10%小牛血清，100 U/mL链霉素，100 U/mL青霉素，每2天换液传代1次，观察有90%以上细胞成单层贴壁生长，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.3 MTT比色实验 取对数生长期人肝癌细胞BEL-7402并调节肝癌细胞悬液浓度为1×106/mL，将肝癌细胞加入96孔板，按每孔100μL种板，边缘孔用无菌水填充，避免产生边缘效应。对照板加入100μL RPMI1640，在实验板中加入PA-MSHA的终浓度分别为10×107/mL、5×107/mL、2.5×107/mL、1.25×107/mL、0.631×107/mL、0.31×107/mL。每孔设5个复孔，分别在37℃5%CO2条件下培养24 h之后每孔加入四甲基偶氮噻唑蓝10μL（0.5%MTT，5 mg/mL），37℃5%CO2条件下培养4 h。离心吸掉上清液，每孔加入100μL二甲基亚砜（DMSO），置于低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪OD 490 mm处测量各孔的吸光值（A值）。取5孔平均A值，同时计算出PA-MSHA对肝癌细胞的杀伤率和存活率。记录结果，绘制细胞在不同药物浓度下的细胞生长曲线。1.2.4透射电镜及光镜观察 取对数生长期的细胞1×106/mL加入6孔细胞培养板内盖上盖玻片，置于5%CO237℃条件下培养20 h，向孔内滴入2.5×107/mL PA-MSHA作为实验组，对照组不加药，实验组及对照组分别与细胞共同培养12、24、40 h，弃除培养液，置于EP管中，2 000 r/min离心15 min弃上清，立即用2.5%戊二醛固定2 h，加入4℃预冷的PBS液漂洗3次，每次10 min，再用1%四氧化锇固定15 min，接着用PBS液漂洗3次。梯度乙醇脱水，环氧树脂包埋，固定包埋块在超薄切片机上并切片。3%枸橼酸铅及醋酸铀双重染色，透射电子镜观察并拍片同时将作用24 h的实验组在电子显微镜下观察及拍片。

1.3 统计学方法

应用SPSS 12.0软件分析所得数据，计量资料采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 光镜下观察细胞形态学变化

将浓度为2.5×107/mL的PA-MSHA与肝癌细胞BEL-7402培养24 h，与对照组同时置于显微镜下观察：实验组细胞核固缩、细胞形态不规整，裂解的碎片被质膜包绕，细胞形态表现为死亡的变化（图1A）；观察对照组肝癌细胞可见细胞形态饱满、细胞膜完整光滑、细胞核完整呈圆形，少见死亡细胞（图1B）。

图1 肝癌细胞24 h细胞形态（×40）

2.2 MTT法检测结果

将不同浓度的实验组培养一定时间后检测各组的平均OD值，用同样的方法检测对照组的平均OD值，根据OD值制图（图2），观察图2得出浓度为10×107/mL、5×107/mL、2.5×107/mL的PA-MSHA对肝癌细胞BEL-7402的杀伤率与对照组比较差异有高度统计学意义（P＜0.01）。

图2 不同浓度PA-MSHA对BEL-7402生长的影响

2.3 透射电镜观察结果

透射电镜观察细胞超微结构变化：实验对照组核膜、核仁完整，高尔基体、内质网、线粒体等细胞器完整清晰；一定浓度的实验组细胞培养12、24 h后肝癌细胞出现皱缩、体积变小、变圆，细胞内可见空泡结构，核染色质凝聚、边缘化，细胞核裂解成有膜包裹的碎块，细胞膜包绕着一部分细胞器即凋亡小体形成；一定浓度的实验组细胞培养40 h时肝癌细胞体积变大，线粒体内腔扩大，细胞核浓缩边集、核碎裂、核溶解，表现为坏死的细胞特征。见图3～5。

图3 对照组肝癌细胞BEL-7402 12 h电镜下细胞形态

图4 实验组肝癌细胞BEL-7402 12 h电镜下细胞形态

图5 实验组肝癌细胞BEL-7402 40 h电镜下细胞形态

3 讨论

目前认为恶性肿瘤的发生与细胞增殖异常、细胞凋亡下降有密切的关系，同时决定肿瘤生长速度[4]。因此，抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡将成为肿瘤治疗的新方向。PA-MSHA能特异性地与高甘露糖表达型的肿瘤细胞结合，诱导肿瘤细胞凋亡[1]，且国内也有报道[5-7]，PA-MSHA在肺癌、膀胱癌、宫颈癌等恶性肿瘤的治疗中起到良好的效果。肝癌发病率为癌症中第6位，病死率第3位[8]，恶性程度高，治疗效果差，寻找高效的治疗药物已经提上日程。

本研究将不同浓度的PA-MSHA与肝癌细胞BEL-7402在体外培养，通过电子显微镜对细胞形态变化的观察，初步发现PA-MSHA对肝癌细胞BEL-7402有杀伤作用。进一步采用MTT检测不同浓度的PA-MSHA对肝癌细胞BEL-7402的杀伤效应，最后利用透射电镜确定PA-MSHA对肝癌细胞BEL-7402的杀伤机制。MTT实验证明，PA-MSHA对肝癌细胞的杀伤效应非常明显，此杀伤效用随着浓度的增大而增强表现为量效关系，在浓度较低时，与对照组相比较对肝癌细胞BEL-7402杀伤作用没有显著性差异，当药物浓度达到10×107/mL、5×107/mL、2.5×107/mL时，药 物 对 肝 癌 细 胞BEL-7402的杀伤效用差异显著（P＜0.01）；透射电镜观察结果表明：肝癌细胞于12、24 h表现典型的细胞凋亡形态特征：肝癌细胞出现皱缩、体积变小、变圆，细胞内可见空泡结构，核染色质凝聚、边缘化，细胞核裂解成有膜包裹的碎块，细胞膜包绕着一部分细胞器即凋亡小体形成；肝癌细胞于40 h发生凋亡与坏死共存的现象，但以细胞坏死形态变化为主：肝癌细胞体积变大，线粒体内腔扩大，细胞核浓缩边集、核碎裂、核溶解，表现为坏死的细胞特征。可见，PA-MSHA对肝癌细胞BEL-7402有杀伤作用，表现为与浓度相关的量效关系，杀伤效应是通过诱导细胞凋亡与坏死而实现的。其对肝癌的治疗有着非常高的研究价值，同时也可能成为抗肿瘤生长的潜在性药物，寄希望于进一步开展实验研究，进而指导临床工作，最终，使肿瘤患者生命延长。

综上所述，PA-MSHA对人肝癌细胞BEL-7402有很强的杀伤作用，发挥杀伤效用的机制初步认为是诱导细胞凋亡和坏死。

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