土生曲霉转化三七中药材的研究

陈有为，苗翠苹，吴少华

云南大学省微生物研究所，西南微生物多样性教育部重点实验室，昆明650091

三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)系五加科Araliaceae植物三七的根，为我国云南传统中药材之一［1］。三七的药用成分与人参所含皂甙类似，主要为人参皂甙Rb1，Re，Rg1，但Rc含量较人参为低，且不含人参皂甙R［2］。三七总皂甙水解后，主要得人参三醇，其次为人参二醇，未检出齐墩果酸［3］。现代药理实验表明，三七皂甙有效成分具有广泛的生理活性，临床证明具有多种功能，如治疗心血管及血液造血系统疾病，中枢神经系统病变，抗脑缺血及抗肿瘤的作用，消炎止痛，肝损伤治疗以及代谢消化系统保护等［4］。基于三七的药理作用及其丰富资源，我们从云南不同地区土壤真菌中，通过筛选分离获得直接转化三七中药材的微生物。本文首次报导以传统中药材三七为原料，通过土生曲霉菌Aspergillus terreus的转化作用，可导致原三七化学成分发生变化，大部分化学成分被降解或分解，而三七中药材具有生理活性的部分原化合物如三七皂苷nR2及人参皂苷Rg1、Rd、Rh1等含量大幅度提高。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

土生 曲 霉 Aspergillusterreus(菌 株 编 号YM31966，保藏号CCTCC NO:M202016)，分离自云南西双版纳自然保护区热带雨林土壤中，云南省微生物研究所保存。

1.1.2 培养基

菌种保藏培养基:麦芽汁培养基。(1)活化斜面培养基:PDA固体培养基。(2)扩大培养基:PDA液体培养基。(3)三七转化培养基:三七粉(颗粒80～100目)，水份65%～70%，PH自然。

1.1.3 转化方式

固态转化。

1.1.4 试剂与仪器

中药材三七(云南文山)。三七皂甙(nR2≥99%)与人参皂甙(Rg1≥98%、Rd≥99%、Rh1≥99%、Rh4≥99%)标准品由中科院昆明植物研究所提供。乙醇(食用级≥95%)，丙酮、氯仿、甲醇实验试剂均为分析纯，乙腈(色谱级)。D-101和D-72大孔树脂(天津)，薄层色谱(TLC)硅胶G和柱层析硅胶(青岛)，反相柱层析填料RP-18(40-75 um，Merck)，凝胶(Sephadex LH-20)。光学显微镜Olympus BH-22，旋转蒸发仪EYELA，紫外光谱仪Shimadzu double-beam 210A，红外光谱仪Bio-Rad FTS-135，高效液相色谱仪Waters HPLC，超导核磁共振仪Bruker DRX 500，质谱仪VG AutoSpec-3000型。

1.2 菌株筛选与鉴定

从云南西双版纳自然保护区土壤分离获得的丝状真菌中，采用固态转化方式，逐一进行三七的微生物转化筛选试验，经TLC与HPLC检测，获得能够直接转化三七的高效菌株。该菌株以麦芽汁、PDA与察氏培养基，28℃培养不同时间观察菌落和显微特征，结合文献［6，7］方法确定菌株的系统学地位。

1.3 微生物的转化

以固态转化方式［8］，将活化好的菌种斜面接入三角瓶中(100 mL液体PDA培养基/500 mL三角瓶)，置28℃±2℃、200 rpm摇床培养4 d得种子液，按10%接种量接入三七转化培养基(100 g/500 mL玻璃瓶)，28℃±2℃静止10 d转化后得转化产物。

1.4 转化产物提取

转化产物采用浓度60%乙醇(m/v:1∶8)浸提48h，收集合并浸提的转化产物浸提液，经D-101大孔树脂层析柱吸附，纯净水冲洗大孔树脂层析柱后，采用梯度乙醇(浓度70%～90%)洗脱，洗脱液经旋转蒸发仪挥去乙醇得粗提液。粗提液再经D-72大孔树脂层析柱脱色，浓度80%乙醇洗脱，脱色后的洗脱液经浓缩得浓缩液。浓缩液按1∶8(v/v)比例加入浓度95%乙醇，室温下放置12 h，过滤弃沉淀物，滤液于40℃下经减压浓缩、干燥后即得三七转化产物总皂甙。

1.5 化合物的分离

三七转化总皂甙(100 g)经硅胶柱层析，用氯仿-甲醇-水(9∶1∶1～6∶4∶1)梯度洗脱，得到At-1 (19.8 g)、At-2(20.2 g)、At-3(13.5 g)、At-4(22.1 g)、At-5(18.9 g)和At-6(16.8 g)六个组分。组分At-1通过硅胶柱色谱(氯仿-甲醇-乙酸乙脂-水(2∶2∶4∶1)、凝胶Sephadex LH-20柱色谱(氯仿-甲醇9∶1～8∶2)得到化合物nR2(80 mg)。组分At-2通过硅胶柱色谱(氯仿-甲醇9∶1～6∶4)、凝胶Sephadex LH-20柱色谱(氯仿-甲醇8∶2～7∶3)分离得到化合物Rg1(220 mg)。组分At-3通过硅胶柱色谱(氯仿-甲醇-水9∶2∶1～8∶2∶0.5)、凝胶Sephadex LH-20柱色谱(100%甲醇)和反向RP-18柱层析(甲醇-水8∶2～1∶0)分离得到化合物Rh1(38 mg)。组分At-4通过硅胶柱色谱(氯仿-甲醇9∶1～6∶4)、凝胶SephadexLH220柱色谱(100%甲醇)和反相RP-18柱层析(甲醇-水8∶2～1∶0)分离得到化合物Rd(201 mg)。组分At-5通过硅胶柱色谱(氯仿-甲醇-水7∶3∶0.5)、凝胶SephadexLH220柱色谱(100%甲醇)和反相RP-18柱层析(甲醇-水8∶2～1∶0)分离得到化合物Rh4(36 mg)。组分At-6通过硅胶柱色谱(氯仿-甲醇-水8∶2∶0.5)、凝胶 Sephadex LH-220柱色谱(100%甲醇)和反相RP-18柱层析(甲醇-水7∶3～1∶0)分离得到化合物RX1(25 mg)。

1.6 转化产物的检测

1.6.1 TLC

展开剂:氯仿-甲醇:水7∶3∶0.5，显色剂(乙醇-硫酸)，对照样品原三七提取物。

1.6.2 HPLC

色谱柱Symmetrym C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)。流动相为乙睛-水98∶2，流速1 mL/min，检测波长203 nm，柱温常温［9］。分析样品的制备精确称取三七皂苷nR2及人参皂苷Rg1、Rd、Rh1和Rh4标准品各3 mg，三七转化总皂苷50 mg，分别置10 mL容量瓶中，甲醇定容。

1.6.3 波谱分析

转化产物提取总皂苷分离各化合物经紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、1H核磁共振(1H NMR)、13C核磁共振(13C NMR)等波谱测定转化产物各化合物结构组成［10-12］。

1.6.4 质谱(MS)

用于三七转化产物总皂苷各化合物分子量的测定［13］。

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定

菌株YM31966在PDA培养基上，28℃培养6 d，菌落直径28 mm，12 d 38 mm。菌落浅咖啡色，扁平疏松粉状，边缘稍不整齐，中间凸起，背面黄褐色，具同心环。麦芽汁培养基28℃培养6 d，菌落直径33 mm，12 d 40 mm。菌落扁平疏松，浅咖啡色粉状，边缘不齐，中部有放射沟纹，背面褐色。察贝克培养基28℃培养6 d，菌落直径23 mm，12 d 37 mm。菌落浅黄带肉红色，粉状中间绒状，稍紧密，边缘不齐，有黄色水珠。背面橘红色，稍具沟纹(见图1)。

菌株YM31966菌丝无色，有隔膜。分生孢子梗从壁厚而膨大的足细胞垂直生出，光滑无色;顶囊半球形，顶部2/3密生小梗;小梗双层;分生孢子穗圆筒形，肉桂色;分生孢子球形光滑。孢子直径1.8微米(见图1)。

图1 土生曲霉(A.terreus)YM31966菌落图片和菌株显微图片Fig.1 Photographs of colonia and morphological micrograph from A.terreus YM31966

YM31966菌株18S rDNA序列全长为1729 bp，经建立系统进化树分析，并与Blast与Gene Bank中的核酸数据进行比对，结果可观察到该菌株与土生曲霉(Aspergillus tamarii)的序列相似性无差异。

土生曲霉(A.terreus)YM31966菌株在以中药材三七为原料的转化基质上，培养2 d长满白色菌丝，菌丝短，发酵物结块。培养4 d大量土红色孢子生长，发酵物紧密呈土黄色。培养6 d发酵物表面长满土红色孢子，发酵物上部分呈土色，下部分呈土黄色。培养8 d发酵物表面长满粉粉的土红色孢子，发酵物上五分之四左右部分呈土色，下五分之一左右部分呈土黄色。培养10 d后发酵物上部分呈米糠色，下部分呈黄绿色，发酵物致密，表面长满糠麸色孢子，靠近瓶底部分呈黄绿色。

2.2 转化产物

2.2.1 三七转化产物组分

以中药材三七为基质，经土生曲霉(A.terreus) YM31966菌株的转化作用，三七转化产物总皂苷成分的组成及化学成分的变化见图2和表1所示。

图2 土生曲霉(A.terreus)YM31966菌株转化三七产物皂甙组分的TLC及HPLC分析Fig.2 The HPLC and TLC graph of compounds from converted Panax notoginseng by A.terreus YM31966

表1 土生曲霉(A.terreus)YM31966菌株对三七化学成分的转化影响Table 1 Effect on converted compounds of Panax notoginseng by A.terreus YM31966

从图2和表1中可看出，与原三七比较，土生曲霉(A.terreus)YM31966菌株转化三七产物主体成分由三七皂苷nR2、RX1及人参皂苷Rd、Rg1、Rh1和Rh4组成。大部分原三七化学成分被该菌株降解，例如原二醇型人参皂苷Rb1、Rc、RY-XVII、nFa及原三醇型人参皂苷Re及三七皂苷nR1、nR3、nR6等成分消失。其中，原二醇型人参皂苷Rd化合物占三七转化产物皂苷总成分的14.06%;人参皂甙Rg1化合物占总成分的51.09%;化合物Rh1为4.8%;而Rh4及RX1化合物分别占总成分的0.5%，相比原三七对应成分其含量得到大幅度提高。

2.2.2 三七转化产物的化合物结构

从三七转化产物总皂甙成分中分离获得6个化合物，分别对转化三七产物的化合物进行 UV、IR、1H NMR、13C NMR及MS等波谱分析，结果At-(1～4)四个化合物的结构分别与原中药材三七皂苷nR2及人参皂甙Rg1、Rh1和Rd的化学结构完全一致［14-16］。At-5化合物为红参特有成分人参皂苷Rh4［17］，而 At-6化合物为转化获得的另一新化合物，暂定名三七皂苷RX1(Notoginsenoside RX1)。

化合物 At-1:三七皂甙 nR2(notoginsenoside R2)，分子式C41H72O13，分子量772，熔点(mp)186～188℃，［α+10.30°(c 1.0，MeOH)。化合物At-2:人参皂甙Rg1(ginsenoside Rg1)，分子式C42H72O14，分子量800，熔点(mp)201～203℃，［α+ 22.30°(c 1.3，MeOH)。化合物At-3:人参皂甙Rh1(ginsenoside Rh1)，分子式C36H62O9，分子量638，熔点(mp)190～192℃，［α+20.0°(c 0.80，MeOH)。化合物 At-4:人参皂甙 Rd(ginsenoside Rd)，分子式C48H82O18，分子量946，熔点(mp)206～208℃，［α+19.5°(c 1.03，MeOH)。化合物At-5:人参皂甙Rh4(ginsenoside Rh4)，分子式C36H60O8，分子量620.43(Molt Wt620.86)。化合物At-6:三七皂苷RX1(notoginsenoside RX1)，分子式C36H60O8，分子量620.43(Molt Wt620.86)，如图3所示。

图3 土生曲霉(A.terreus)YM31966菌株转化三七产物的化合物结构Fig.3 Structures of compounds from converted Panax notoginseng by A.terreus YM31966

3 讨论

本研究分离获得可直接转化三七中药材的微生物土生曲霉(A.terreus)YM31966菌株，以云南文山三七中药材为原料，通过该菌的转化作用，结果表明可分解或修饰原三七皂苷成分的组成和含量，出现新化合物三七皂苷RX1及新成分人参皂苷Rh4，转化产物使得原药材的生物活性作用得到进一步的增强成为可能，这为中草药或天然药物新药成分的发现开辟了一条途径。

与三七原中药材比较，土生曲霉(A.terreus) YM31966菌株的三七转化产物总皂苷分别由人参二醇型皂苷Rd及原人参三醇型皂苷由nR2、Rg1、Rh1、Rh4和RX1苷元构成。原人参二醇型皂苷Rd含量提高了85%左右;原三七人参二醇型皂苷Rb1、nR4、RY-XVII、nFa等化合物消失。原人参三醇型皂苷Rg1化合物含量平均增加48%;人参皂苷Rh1和nR2化合物含量分别提高35.2%和13.9%，而人参皂苷Re和三七皂苷nR1、nR3、nR6等化合物被分解消失。表明该菌转化三七不仅可使原三七化合物种类组成发生变化，也能促使原三七某些化学成分含量增长。在分析中药材三七转化产物化合物的结构时，结果也证实皂苷Rd、nR2、Rg1、Rh1的化学结构与三七原中药材人参皂苷和三七皂苷成分的化学结构一致。而Rh4是首次从三七转化产物中分离得到的人参皂甙，RX1是土生曲霉(A.terreus)YM31966菌株直接转化三七形成的三七皂苷新化合物。

关于三七中药材的微生物转化物质途径与微生物酶反应直接相关。人参二醇型皂苷Rd来源于三七皂苷Rb1经土生曲霉(A.terreus)YM31966菌株β (1→2)葡萄糖苷酶分解葡萄糖形成。人参皂苷Rh1是由三七皂苷R2经该菌β(1→2)木糖酶分解木糖形成。通过β(1→2)木糖酶分解三七皂苷R2木糖，再经脱氢酶发生羟基化反应转化成人参皂苷Rh4和三七皂苷RX1，区别在于人参皂苷Rh4为三七皂苷R2甾醇结构20位碳原子上配糖体R2=H发生羟基化反应，而三七皂苷RX1则是三七皂苷R2甾醇结构21位碳原子上配糖体R2=H发生羟基化反应，经脱氢作用形成双键。有关人参皂苷Rg1数量的增加则是由部分三七皂苷R1配糖体结构经该菌β(1→2)木糖酶分解木糖所导致，其转化物质途径的机理还有待进一步研究。

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