白芍总苷在正常大鼠体内的组织分布研究

张玲非，李向军，王玉峰，刘敏彦，王鑫国，牛丽颖*

1河北医科大学中医学院河北省实验动物重点实验室，石家庄050091;2石家庄以岭药业股份有限公司，石家庄050035

白芍为毛茛科植物芍药水煮后去外皮的干燥根，性微寒，味苦酸，归肝脾经，具有养血柔肝、缓急止痛、敛阴收汗之功效。白芍总苷(Total glucosides of paeony，TGP)是白芍根中提取的有效部位，具有抗炎、止痛、保肝的作用，还能抑制自身免疫反应，对类风湿关节炎有良好疗效［1］。研究表明，TGP主要含有芍药苷(Paeoniflorin，Pae)、芍药内酯苷(Albiflorin，Alb)、羟基芍药苷、苯甲酰芍药苷等单萜类成分，Pae和Alb含量最高［2］。近年来对TGP药动学参数研究取得了一定进展［2，3］，可是其组织分布特点研究较少。本研究以Pae和Alb为指标，研究了单剂量灌胃TGP后正常大鼠体内的组织分布情况。

1 材料与方法

1.1 试药与试剂

芍药苷对照品(由四川省维克奇生物科技有限公司提供，纯度≥98%);芍药内酯苷对照品(由四川省维克奇生物科技有限公司提供，纯度≥96. 5%);白芍总苷(实验室自制，其中芍药内酯苷含量15.2%，芍药苷含量42.6%);乙腈(色谱纯，美国Fisher试剂公司);水为蒸馏水;其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

高效液相色谱仪(Waters 1525 Binary HPLC Pump)，配有紫外检测器(Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector)，自动进样器(Waters 717 plus Autosampler);冷冻干燥机(ALPHA1-4);AG135型分析天平(瑞士METTLER-TOLEDO公司);GT16-3高速离心机(北京时代北利离心机有限公司);MTN-2800D型氮吹仪装置(天津奥特赛恩斯仪器有限公司);ZH-2 BLENDER型旋涡仪(天津药典标准仪器厂制造)。

1.3 动物

健康Wistar大鼠15只，♂，体重为180±20 g，由河北医科大学实验动物中心提供，合格证号: 1008155。在恒温(24±2℃)、光照周期12 h∶12 h环境中饲养1周后实验。

1.4 色谱条件

色谱柱为 phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为乙腈-0.05%甲酸，肝组织流动相比例为15∶85，肾组织比例为14∶86，心、肺、脾、胃、小肠、大肠比例为12∶88;流速1 mL/min;检测波长230 nm;柱温25℃。结果显示在上述条件下，各组织样品中的Pae、Alb和内标(IS)峰形良好，理论塔板数均大于5000(见图1-8)。

图1 大鼠心脏冻干粉色谱图Fig.1 Chromatograms of paeoniflorin and albiflorin in rat heart freeze-dry powder

1.5 组织样品的预处理

取各组织样品(心、肝、脾、肺、肾0.5 g，胃、小肠、大肠0.3 g)，精密称定，按1∶4(重量/体积比)加入4℃生理盐水，冰浴匀浆3 min，将匀浆液置5 mL离心管中，于-40℃保存24 h以上，冷冻干燥，称定各组织冻干粉的重量，计算各组织每克冻干粉相当于组织的重量。

取心脏组织冻干粉0.05 g，加入10 μL龙胆苦苷溶液(IS)(256 μg/mL)，加入600 μL甲醇，涡旋混匀，离心(12000 r/min，10 min)，取上清液，N2下吹干，150 μL甲醇复溶，10 μL进样分析。

取肝、肾、肺、脾组织冻干粉0.05 g，加入10 μL IS溶液(512 μg/mL)，取胃，小肠，大肠组织冻干粉0.01 g，加入20 μL IS溶液(512 μg/mL)，加入600 μL甲醇，涡旋混匀，离心(12000 rpm，10 min)，取上清液，10 μL进样分析。

1.6 标准曲线

取空白心冻干粉，加入适量 Pae和Alb标准溶液，制成含Pae 7.42、14.84、29.68、59.36、118.72、237.44 μg/g，Alb 4.9、9.8、19.6、39.2、78.4、156.8 μg/g的系列样品，加入IS溶液，补充甲醇至600 μL，其余按“1.5”项下操作。

取空白肝、肾、肺、脾冻干粉，加入适量Pae和Alb标准溶液，制成含 Pae 14.84、29.68、59.36、118.72、296.8、593.6、1187.2 μg/g，Alb 9.8、19.6、39.2、78.4、196、392、784 μg/g的系列样品，加入IS溶液，补充甲醇至600 μL，其余按“1.5”项下操作。

取空白胃、小肠、大肠冻干粉，加入适量 Pae和Alb标准溶液，制成含Pae 728.75、1457.5、2915、7287.5、14575 μg/g，Alb 222、444、888、2220、4440 μg/g的系列样品，加入IS溶液，补充甲醇至600 μL，其余按“1.5”项下操作;建立Pae和Alb的标准曲线。

测得各组织中Pae和Alb的标准曲线(见表1)，最低定量浓度分别为标准曲线最低点(S/N＞10)。

表1 各组织冻干粉中Pae和Alb的回归方程与线性范围Table 1 Regression equation and linear rang in tissue freeze-dry powder

1.7 日内精密度与准确度

根据“1.6”项下方法，以空白组织冻干粉配制低、中、高(心 Pae 14.84、59.36、237.44 μg/g，Alb 9.8、39.2、156.8 μg/g;肝、肾、肺、脾 Pae 29.68、118.72、593.6 μg/g，Alb 19.6、78.4、392 μg/g;胃、小肠、大肠 Pae 728.75、2915、14575 μg/g，Alb 222、 888、4440 μg/g)3个不同浓度的组织样品，记录峰面积比值，根据随行标准曲线求得日内精密度与准确度。结果显示低、中、高3个浓度各组织Pae和Alb的日内精密度RSD%均在10%以内，准确度均在(100±10)%以内，符合生物样品分析方法的要求。

1.8 日间精密度

以空白组织冻干粉配制低、中、高3个不同浓度的组织样品，每一浓度1个样本，连续3天，记录峰面积比值，根据随行标准曲线求得日间精密度。结果显示低、中、高3个浓度各组织Pae和Alb的日间精密度RSD%均在10%以内。

1.9 提取回收率

以空白组织冻干粉配制低、中、高3个不同浓度的组织样品，每一浓度进行5样本分析，计算待测峰与内标峰面积之比，记为a;取空白组织冻干粉按“1.5”项下方法操作，提取上清液，取低、中、高3个不同浓度的Pae、Alb标准溶液，N2下吹干，加入提取的上清液，涡旋混匀，进样，计算待测峰与内标峰面积之比，记为b，a/b即为提取回收率。内标溶液经同法处理。结果低、中、高3个浓度各组织的回收率分别为 Pae 68.75%-76.30%(n=5)，Alb 69.82%～76.62%(n=5)，IS经同法提取处理，其回收率为71.98%～80.23%(n=5)，RSD%均在10%以内。

1.10 稳定性

考察了组织样品预处理后室温放置4、8、12、24 h后的稳定性，结果显示样品预处理后室温放置测得的RSD%均在10%以内，表明Pae和Alb在预处理后的溶液中稳定。

1.11 样品的采集

按体重将大鼠随机分为3组，每组5只，实验前禁食12 h，自由饮水，按2.82 g/kg体重灌胃给予TGP水溶液(10 mL/kg)，分别于1 h、3 h、6 h以10%水合氯醛麻醉大鼠，立即取出心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、大肠等组织(其中小肠自胃下取10 cm左右，大肠自盲肠下取10 cm左右)，用生理盐水冲净组织表面血迹及内容物，拭干，装入自封袋中，-20℃保存，备用。

2 结果与讨论

2.1 结果

各组织重量与冻干粉重量比值:心 5.61、肝3.37、脾 4.37、肺 5.68、肾 3.81、胃 4.56、小肠4.09、大肠5.21。

测得各组织冻干粉中Pae和Alb浓度，根据各组织冻干粉中Pae和Alb浓度及组织重量与冻干粉重量比值计算各组织中两者浓度，结果见表2、图9，各时间点各组织中两者浓度大小如下:

1 h Pae浓度顺序为:小肠＞胃＞大肠＞肾＞肝＞肺＞脾＞心

Alb:小肠＞胃＞大肠＞肝＞肾＞肺＞脾＞心

3 h Pae浓度顺序为:小肠＞胃＞大肠＞肾＞脾＞肝＞肺＞心

Alb:小肠＞胃＞大肠＞肾＞脾＞肝＞肺＞心

6 h Pae浓度顺序为:小肠＞大肠＞胃＞肾＞肝＞脾＞肺＞心

Alb:小肠＞大肠＞胃＞肾＞肝＞肺＞脾＞心

表2 大鼠灌胃给予2.82 g/kg TGP后各组织中Pae和Alb的分布(±s，n=5)Table 2 Distribution of albiflorin and paeoniflorin in tissues after an oral administration of 2.82g/kg TGP in rats(±s，n=5)

表2 大鼠灌胃给予2.82 g/kg TGP后各组织中Pae和Alb的分布(±s，n=5)Table 2 Distribution of albiflorin and paeoniflorin in tissues after an oral administration of 2.82g/kg TGP in rats(±s，n=5)

浓度Concentration(μg/g)芍药内酯苷Albiflorin 芍药苷Paeoniflorin 1±0.83 17.39±5.43 1.52±0.08肝Liver 36.02±11.08 38.13±7.50 6.83±1.75 57.86±11.51 100.06±28.44 10.18±2.65脾Spleen 6.27±1.76 46.60±11.08 3.33±0.70 13.55±4.68 124.78±33.66 9.82±3.52肺Lung 25.40±4.83 28.18±8.97 4.40±1.68 54.31±12.23 90.71±21.26 4.90±0.87肾Kidney 35.14±10.49 57.28±10.56 10.97±4.18 88.24±23.21 134.76±26.13 29.80±7.62胃Stomach 574.77±140.97 400.12±130.17 57.23±8.90 1332.97±259.72 977.22±271.46 166.66±6.43小肠Small intestine645.70±118.55 414.41±81.38 359.15±101.16 1651.99±290.93 1096.84±392.33 922.98±273.53大肠Large intestine169.48±21.23 342.34±75.30 252.94±75.92 436.39±155.54 902.08±145.31 6 1 h 3 h 6 h 1 h 3 h 6 h心Heart 1.14±0.30 6.95±2.71 1.09±0.18 3.1 14.09±202.18

图9 大鼠灌胃给予2.82 g/kg TGP后各组织中Pae和Alb的分布(n=5)Fig.9 Distribution of paeoniflorin and albiflorin in tissues after an oral administration of 2.82 g/kg TGP in rats(n=5)

2.2 讨论

药物进入血液后，随血液分布到机体各组织中，了解药物的组织分布特点，有助于了解药物作用的靶器官，预测药物的药理作用，对扩大药物的临床用途有着重要意义;组织分布研究还提供了药物的蓄积部位和程度，对于预测药物不良反应和毒副作用有重要的指导意义;研究中药的组织分布还可以给中药归经理论提供一定的现代理论支持，白芍归肝脾经，可是对其现代研究较少，研究TGP的组织分布特点有助于进一步阐明白芍归经的实质［4，5］。

组织中药物含量常常因为太低，较难测出，本实验在本课题TGP药动学参数研究的基础上，并经过预实验，以高效液相色谱法为研究手段，选择230 nm作为检测波长，乙腈-0.05%甲酸作为流动相，龙胆苦苷为内标，调节流动相比例，来满足各组织冻干粉中样品的测定。样品预处理方面本实验采用生理盐水将组织匀浆后，尝试了以高氯酸沉蛋白及乙酸乙酯萃取等法进行提取，结果由于含量太低，不易测出;后尝试将定量的组织匀浆液冷冻干燥处理，称取一定量的冻干粉作为预处理样品，将冻干粉进行乙酸乙酯提取、甲醇提取、高氯酸沉蛋白等法，结果发现以甲醇提取率最高，此法相当于浓缩过程，克服了含量太低难测出的缺陷。

本实验研究了灌胃TGP后1、3、6 h三个时间点的组织分布情况，分别代表组织分布的吸收分布相、平衡相、消除相。1 h各组织中均能检测到Pae和Alb，说明TGP分布较迅速而且广泛，这与本课题研究TGP血浆结合蛋白率低相吻合，正是由于其血浆蛋白结合率低，所以游离型药物浓度较高而能迅速转移到组织;小肠壁、胃壁、大肠壁中Pae和Alb浓度最高，可能是因为小肠为主要吸收器官，其次是肾肝及肺等组织，可能是因为这些组织血流量较大，心脾中浓度较小，可能由于两者与心脾亲和力较小。3 h除胃和小肠外，其他各组织中两者含量都达到高峰;胃壁及肠壁浓度最高，为文献报道TGP对三硝基苯磺酸诱导的大鼠结肠炎具有保护作用［6］及白芍具有泻下作用［7］提供了药动学上的支持，其次是肾、脾、肝，为文献报道TGP对糖尿病大鼠早期肾损害［8，9］及肝损伤［10，11］大鼠具有保护作用提供了依据，说明TGP组织分布情况与其药效密切相关;胃、肝、脾中浓度较高可能与传统中医理论中白芍养血柔肝、缓急止痛，治疗胸胁脘腹疼痛的作用有关，为进一步研究白芍的药理作用及作用机理提供了指导;白芍归肝脾经，TGP主要分布于胃肠及肾脾肝，与其归经部位有些差异，但也为白芍的归经理论及相关研究提供了一定的现代科学依据;6 h小肠壁、大肠壁及胃壁中浓度较高，说明口服TGP后容易在胃肠道蓄积，印证了TGP治疗类风湿关节炎和强直性脊柱炎时有轻微的胃肠不良反应，如腹泻、便稀等［1，12］，其次是肾中浓度较高，推断肾可能是原型TGP的主要排泄器官，其他各组织中两者浓度都较小，说明TGP口服后在肝、脾、肺、心等组织中蓄积较少，通过比较发现各组织中Pae比Alb浓度下降稍快，可能组织中Pae比Alb代谢稍快，具体机制还需进步研究。

本研究考察了TGP在正常大鼠体内的组织分布情况，发现灌胃TGP后组织分布迅速且广泛，胃、小肠、大肠及肾、脾、肝是主要分布器官，TGP容易在胃肠蓄积，其他组织中蓄积较少，其组织分布特点与其现代药理作用、不良反应及归经理论有一定的关联，为进一步研究白芍总苷的药理作用及作用机理提供了指导，同时也为白芍的归经理论提供了一定的科学依据。

1 Min WQ(闵伟琪)，Wei Q(魏琴)，Li HY(李洪毓)，et al.A clinical study of total glucosides paeony in the treatment of rheumatoid arthritis.Chin J Rheumatol(中华风湿病学杂志)，2005，9:487-491.

2 Wang Q(王巧).Study on the method of quality control of paeony root and pharmacokinetic of total glucoside of paeony.Shenyang:Shenyang Pharmaceutical University(沈阳药科大学)，PhD.2005.

3 Liu B(刘斌).Study on pharmacokinetics of multi-dose of paeoniflorin in normal rats.Anhui:Anhui Medical University (安徽医科大学)，Master.2009.

4 Liu P(刘萍)，Wang P(王平)，Chen G(陈刚)，et al.Study and thinking on channel entry theory of the traditional Chinese medicine.Liaoning J Tradit Chin Med(辽宁中医杂志)，2010，37:2339-2341.

5 Lu GW(陆光伟).Channel Entry of the Traditional Chinese medicine and Distribution of the components in body.Chin Tradit Patent Med(中成药研究)，1984，20:38-39.

6 Zhou J(周进)，Wu ZX(吴正祥)，Yang JH(杨九华)，et al.Effect of total glucosides of paeony on TNBS-induced Experimental Colitis in Rats.Chin J Gastroenterol(胃肠病学)，2009，14:154-158.

7 Qin JJ(覃俊佳)，Qin P(覃平)，Luo YD(罗宇东)，et al.Experimental study on the mechanism of purgation effect of paeony.Chin J Tradit Med Sci Technol(中国中医药科技)，1998，5:155-157.

8 Fang F(方芳).Effects of total glucosides of paeony on oxidative stress in the kidney of diabetic rats.Anhui:Anhui Medical University(安徽医科大学)，Master.2008.

9 Su J(苏静)，Wu YG(吴永贵)，Zhang JJ(张晶晶)，et al.Effect of total glucosides of paeony on activation of JAK/ STAT pathway in the kidney from diabetic rat.Chin J Mod Med(中国现代医学杂志)，2009，19:362-366.

10 Li RL(李瑞麟)，Ma Y(马勇)，Wei W(魏伟)，et al.Pharmacological effects of total glucosides from paeony root on CCl4-induced liver fibrosis and function of hepatic stellate cells.Chin J New Drugs(中国新药杂志)，16:685-689.

11 Cui W(崔巍).The beneficial effect of TGP in hepatic ischemia and reperfusion injury in rats.Anhui:Anhui Medical U-niversity(安徽医科大学)，Master.2006.

12 Li ZJ(李志军)，Liu Y(刘雁)，Mei YJ(梅永君)，et al.E-valuate the efficacy of TGP(白芍总苷)in the treatment of ankylosing spondylitis and investigate the mechanism of the efficacy.Pharm Clin Chin Mater Med(中药药理与临床)，2009，25:68-70.