乙酰肝素酶和血管内皮生长因子C mRNA的表达与肺癌侵袭和转移的分子生物学

苏树伟 田 辉 李 林 岳韦名 高 存 司立博 (山东省交通医院胸外科，山东 济南 25003)

肺癌的侵袭和转移是导致肺癌病人死亡的主要因素。乙酰肝素酶(HPSE)和血管内皮生长因子(VEGF)-C mRNA的表达是否与肺癌的侵袭性生长和淋巴结转移有关，尚未见文献报道。本研究同时采用RT-PCR法检测了65例肺癌组织、癌旁组织和正常肺组织中HPSE和VEGF-C mRNA的表达，以探讨HPSE和VEGF-C mRNA的表达与肺癌侵袭和转移的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料 所有病例均来源于山东大学齐鲁医院胸外科2006年9月至2007年7月间经临床病理确诊的65例肺癌病人，患者术前均未行放、化疗。其中男性51例，女性14例，年龄41～76岁，中位年龄61岁。病程1～12个月，平均3.6个月。鳞癌31例(47.7%)，腺癌25例(28.5%)，大细胞癌3例(4.6%)，小细胞癌6例(9.2%)。高分化癌17例(26.2%)，中分化癌23例(35.4%)，低分化癌16例(24.6%)，未分化癌9例(13.8%)。65例患者无住院期间死亡，术后随访至2002年12月;实访61例，失访4例，随访率93.8%。

1.2 标本的采集和保存 全部标本均在手术中收集，取材后速冻于液氮中，-80℃超低温贮存备用。肿瘤组织均在原发灶取材，避开坏死、炎症区域;癌旁组织取自相应肿瘤旁2 cm;非癌组织(远癌肺组织或正常肺组织)取自距肿瘤边缘5 cm以上之肺组织，并经病理学检查未见癌细胞。

1.3 RT-PCR法检测HPSE mRNA 以TRIzol试剂(Gibco公司)提取总RNA，具体操作按厂家推荐步骤进行。提取后以紫外分光光度计(Bio-Rad公司)测定其纯度(A260/A280≥1.8)并定量，在1%甲醛变性凝胶上电泳验证RNA完整性。半定量RTPCR检测HPSE mRNA表达，采用一步法试剂盒(Katara公司)中的厂家推荐步骤进行，扩增体积50 μl。以持家基因GAPDH扩增产量为内参照，对样品模板用量标准化。HPSE和GAPDH分两管进行扩增。引物序列参照文献〔1〕设计:HPSE上游引物:5'-TTCGATCCCAAGAAGAAGGAATCAAC-3'，下游引物:5'-GTAGTGATGCCATGTAACTGAATC-3';GAPDH上游引物:5'-TCCTGCACCACCAACTGCTT-3'，下游引物:5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。RT-PCR条件参考文献〔1〕并稍加优化:50℃ 逆转录30 min，94℃变性 45 s，60℃退火 45 s，72℃延伸 45 s，28 个循环;72℃充分延伸5 min。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，以Fluor-S多功能成像系统(Bio-Rad公司)扫描并拍照。

1.4 RT-PCR法检测 VEGF-C mRNA总RNA提取试剂，逆转录试剂盒，VEGF-C的 RT-PCR特异引物序列由Life Technologies公司合成，片段长度183 bp。上游引物:5'-TGTACAAGTGTCAGCTAAGG-3';下游引物:5'-CCACATCTATACACACCTCC-3'。β-actin 片段长度 268 bp，上游引物:5'-CAACTTCATCCACGTTGACC-3'，下游引物:5'-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3'。PCR 循环参数:94℃，1 min;55℃，90 s;72℃，90 s。循环 30次，在72℃延伸10 min。以试剂盒提供之对照RNA样品及其特异性引物的扩增产物为阳性对照，以反应系统中不加模板RNA的扩增产物为阴性对照，以β-actin为内对照。PCR产物采用2%琼脂糖凝胶电泳，紫外线灯下观察，与Markers对比碱基对大小，以出现明显与目的基因碱基相同的区带为阳性〔2〕。

1.5 统计学处理 计量资料采用方差分析及t检验，多计量资料之间的关系比较用多元线性回归分析，应用SPSS12.0软件进行统计学分析。

2 结果

2.1 HPSE和VEGF-C mRNA在正常肺组织、癌旁组织和肺癌组织中的表达 RT-PCR结果显示，肺癌组织中HPSE和VEGFC mRNA阳性表达率(55.4%、61.5%)明显高于癌旁组织和正常肺组织(12.3%、15.4%;3.1%、4.6%，P ＜0.05)，见图1，图2。

2.2 HPSE和VEGF-C mRNA表达与肺癌组织类型、分化程度、分期及预后 不同类型和不同分化程度肺癌组织中HPSE和VEGF-C mRNA的阳性表达率比较无显著差异(P＜0.05);Ⅲ期和Ⅳ期肺癌组织中HPSE和VEGF-C mRNA阳性表达率明显高于Ⅰ期和Ⅱ期(P＜0.05);生存3年以下肺癌HPSE和VEGF-C mRNA阳性表达率明显高于生存3年以上者(P＜0.05)，图3、图4和见表1。

图1 ODC mRNA琼脂糖凝胶电泳图谱(HPSE)

图2 ODC mRNA琼脂糖凝胶电泳图谱(VEGF-C)

图3 HPSE基因mRNA表达

图4 VEGF-C基因mRNA表达

表1 HPSE mRNA、VEGF-C mRNA阳性表达与肺癌组织类型、分化程度、分期及预后〔n(%)〕

3 讨论

侵袭和转移是恶性肿瘤的重要特征，也是影响肿瘤患者治愈率的主要因素。HPSE可在数个位点上降解硫酸乙酰肝素，破坏细胞外基质和基底膜的完整性，从而有利于肿瘤细胞穿越细胞外基质和血管壁，促进其侵袭和转移;同时还有利于血管内皮细胞的迁移和生长，促进新生血管的形成〔3～5〕。VEGF-C是唯一可与内皮细胞膜上的VEGFR-3(Flt4)结合并特异性促进淋巴管生长的因子，当其与受体Flt-4结合后，可促进肿瘤淋巴管内皮细胞的迁移和增殖〔6～9〕。本研究提示HPSE mRNA表达在肺癌的生长、侵袭和转移以及血管生成中发挥着作用，HPSE参与了肺癌组织的血管形成和肺癌细胞的扩散转移。VEGF-C是促进肿瘤经淋巴转移的重要因素，因此可以推测肺癌细胞分泌VEGF-C，可能通过激活支气管壁淋巴管内皮细胞膜上的VEGFR-3引起肿瘤周围淋巴管增生，或诱导肿瘤内淋巴管形成，从而使肿瘤细胞通过淋巴管进行转移和扩散;由此可见，肺癌的生长、侵袭和转移可能是HPSE促微血管生成和VEGF-C促淋巴管生成协同作用所致。

本研究结果提示HPSE和VEGF-C mRNA在促进肺癌侵袭和转移中可能具有普遍意义。HPSE和VEGF-C mRNA高表达的肿瘤细胞侵袭和转移的能力强，HPSE和VEGF-C mRNA在促进肿瘤细胞穿越血管壁、实行扩散和转移中发挥着作用，结果提示HPSE和VEGF-C mRNA可作为判断肺癌生物学行为和患者预后的一个参考指标。

1 Watanabe M，Aoki Y，Kase H，et al.Heparanase expression and angiogenesis in endometrial cancer〔J〕.Gynecol Obstet Invest，2003;56(2):77-82.

2 Vlodavsky I，Friedmann Y，Elkin M，et al.Mammalian heparanase:gene cloning，expression and function in tumor progression and metastasis〔J〕.Nat Med，1999;5(7):793-802.

3 Assal N，Yamanoi A，Ono T，Set al.The clinicopathologicalsignificance of heparanase and basic fibroblast growth factor expressions in hepatocellular carcinoma〔J〕.Clin Cancer Res，2001;7(5):1299-305.

4 Vlodavsky I，Elkin M，Pappo O，et al.Mammalian heparanase as mediator of tumor metastasis and angiogenesis〔J〕.Isr Med Assoc J，2000;2(Suppl):37-45.

5 Ikuta M，Podyma KA，Maruyama K.Expression of heparanase in oral cancer cell lines and oral cancer tissues〔J〕.Oral Oncol，2001;37(2):177-84.

6 Kirkin V，Mazitschek R，Krishnan J，et al.Characterization of indolinones which preferentially inhibit VEGF-C and VEGF-D-induced activation of VEGFR-3 rather than VEGFR-2〔J〕.Eur J Biochem，2001;268(21):5530-40.

7 Kamsda K，Oike Y，Takakura N，et alS.VEGF-C signaling pathways through VEGFR-3 in vasculoangiogenesis and hematopoiesis〔J〕.Blood，2000;96(12):3793-800.

8 Witte D，Thomas A，Ali N，et al.Expression of the vascular endothelial growth factor receptor-3(VEGFR-3)and its ligand VEGF-C in human colorectal adenocarcinoma〔J〕.Anticarcinoma Res，2002;22(3):1463-6.

9 Fitzpatrik TE，Lash GE，Yanaihara A，et al.Inhibition of breast carcinoma and trophoblast cell invasiveness by vascular endothelial growth factor〔J〕.Exp Cell Res，2003;283(2):247-55.