TGF-β1在甲状腺乳头状癌中的表达及意义

赵长祺 于海龙 杨坤宝 赵耀红 路国兵 (承德医学院基础医学部，河北 承德 067000)

甲状腺癌是头颈部常见的恶性肿瘤，其中甲状腺乳头状癌(PTC)约占甲状腺癌的60% ～70%〔1〕。国内外研究表明，甲状腺癌是多因素作用的结果，其发生的具体机制尚未完全揭示。转化生长因子(TGF)是一种多功能的细胞因子，其中TGF-β1在调节甲状腺癌的发生、发展及预后中起到了重要作用，对肿瘤的生长有促进作用〔2〕。本文采用免疫组化法和Western印迹检测TGF-β1在甲状腺癌组织及正常组织中的表达，探讨二者在甲状腺癌治疗上的临床意义。

1 材料与方法

1.1 临床标本 2009年9月至2010年8月承德医学院附属医院的甲状腺乳头状癌组织标本60例，癌周组织20例，年龄45～65岁，其中男21例，女39例。患者临床资料完整，术前均未接受化疗和放疗，均为经典根治术，经病理检查证实均为原发甲状腺乳头状癌。所有临床病理标本经10%甲醛溶液固定，常规脱水透明、浸蜡、包埋，连续切片，切片厚4 μm，用于TGF-β1免疫组织化学染色;临床病理标本新鲜组织用于蛋白印记杂交检测。

1.2 主要试剂 兔抗TGF-β1多克隆抗体(美国Sigma公司);羊抗兔IgG二抗(美国Rockland公司);免疫组化试剂盒(美国Invitrogen公司)。

1.3 TGF-β1蛋白免疫组化染色 石蜡切片常规脱蜡至水，微波修复抗原室温孵育20 min，以消化内源性过氧化物酶，10%正常羊血清封闭30 min，分别加一抗TGF-β1，湿盒中孵育，4℃过夜，滴加二抗，Envision试剂室温孵育1 h。各步骤间均以0.01 mol/L PBS缓冲溶液冲洗5 min连续3次。显微镜下控制显色时间，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片，显微镜观察、照相。用PBS缓冲溶液代替一抗作为阴性对照，以甲状腺乳头状癌癌周组织作对照组。细胞质和部分细胞核着棕色颗粒者为TGF-β1阳性，不着色者为阴性。

1.4 TGF-β1蛋白印记杂交检测 提取组织总蛋白，BCA法进行蛋白浓度定量，应用蛋白印记杂交法对甲状腺癌及癌周组织TGF-β1的蛋白水平进行检测。一抗选用兔抗TGF-β1多克隆抗体，二抗选用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，β-actin作为内参，应用Western印迹方法检测甲状腺癌及癌周组织TGF-β1蛋白的表达水平。蛋白上样量40 μg，10%SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，抗体孵育(一抗终浓度2 μg/ml)，采用化学发光法显色，暗室X光胶片曝光，采用Alpha Innotech软件分析照片中蛋白条带的灰度值，并计算各待测条带与其相应内参β-actin的灰度值比值。

1.5 统计学处理 采用SPSS12.0统计软件，组间差异显著性用方差分析法检验，组间两两比较用LSD-t检验。

2 结果

2.1 TGF-β1在甲状腺癌组织中的表达 TGF-β1阳性染色呈棕黄色细颗粒状，前者主要表达于胞质内，细胞核也有表达，后者主要表达在甲状腺癌周围间质的血管内皮细胞。TGF-β1甲状腺乳头状癌组织中的阳性表达(70.26%±12.39%)明显高于癌周组织(33.27% ±6.98%)(P＜0.05)。见图1。

图1 甲状腺乳头状癌TGF-β1表达，胞质内可见棕黄色的阳性颗粒(×200)

2.2 甲状腺乳头状癌组织中TGF-β1的相关性 对甲状腺乳头状癌及癌周组织TGF-β1蛋白的Western印迹检测结果，见图2。TGF-β1蛋白分子量为25 kD，与空白对照组相比，甲状腺乳头状癌组织中TGF-β1蛋白的表达明显升高。以各待测条带与其相应内参β-actin的灰度值比值做统计学分析，结果表明，与空白癌周组织TGF-β1(0.32±0.04)相比，甲状腺癌组织TGF-β1蛋白的表达(0.71±0.13)显著上调。见图2。

图2 甲状腺乳头状癌中TGF-β1的表达

3 讨论

TGF-β1为25 kD的二聚体多肽，主要在内皮细胞、血细胞、结缔组织细胞和上皮细胞中表达。目前认为，TGF-β1促进肿瘤发生机制并非直接促进肿瘤细胞增殖，而是肿瘤细胞对TGF-β1诱导的抑制信号失去敏感性，以及TGF-β1抑制免疫反应，促进肿瘤基质生成等多种生物学作用的结果，是调节细胞增殖和分化的多功能细胞因子〔3〕。TGF-β1还可促使血管生成，刺激血管平滑肌细胞增生和分化，使血管样结构成为稳定的、成熟的血管床，导致肿瘤转移〔4〕。本研究表明，TGF-β1蛋白在甲状腺乳头状癌组织中表达显著高于癌周组织。提示，TGF-β1与甲状腺肿瘤的发展和转移有关，且其在蛋白水平上具有促进肿瘤血管生成、侵袭的能力。

综上，甲状腺乳头状癌TGF-β1的表达与甲状腺乳头状癌的发展及转移相关，TGF-β1表达逐渐增强，是甲状腺乳头状癌病情进展和肿瘤转移的重要信号。TGF-β1表达越高，肿瘤转移性越强，预后越差。提示甲状腺乳头状癌中TGF-β1表达水平可作为判断临床疗效和预后的指标。

1 Singh N，Rogers P，Atwood CW，et al.Short-course empiric antibiotic therapy for patients with pulmonary infiltrates in the intensive cane unit〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2000;162(2):505-11.

2 Tovng PL，Chan WY.Decreased expression of human papillo mavirus E2 protein and transforming growth factor-beta l in human cervical neoplasia as nearly marker in carcinogenesis〔J〕.J Surg Oncol，2003;84(1):17-23.

3 Shariat SF，Kim JH，Andrews B，et al.Preoperative plasma levels of transforming growth factor beta 1 strongly predict clinical outcome in patients with bladder carcinoma〔J〕.Cancer，2001;92(12):2985-92.

4 丁国芳，徐银峰，杨最素，等.TGF-β1在前列腺癌中的表达及其与生存率关系的研究〔J〕.浙江医学，2006;28(9):709-11.