以离体肝灌流技术研究当归对黄药子肝毒性的保护作用

刘海洋，路瑞华，李伟，王加志

(1．黑龙江中医药大学佳木斯学院，黑龙江 佳木斯 154007;2黑龙江省中医研究院，黑龙江 哈尔滨 150036)

离体肝灌流技术最初由英国生理学家Trowell［1］于1942年创立，1951年Miller［2］改进了灌流方法。近年来，离体肝灌流(ILP)技术被广泛用于药理毒理学研究，在进行离体肝灌流实验时，灌流液中的药物未经肠道菌群代谢、消化酶及消化道上皮细胞的影响，化合物均以原形存在于灌流液中，直接与肝细胞相接触产生作用，排除体内其他细胞因子、激素等的影响。

1 实验材料

1．1 药物与试剂

受试药物购于黑龙江省药材公司，黄药子产地河北，经黑龙江省药检所鉴定为薯蓣科植物黄独(Dioscorea bulbifera L)的块茎。当归产地四川，经黑龙江省药检所鉴定本品为伞形科植物当归(Angelica sinensis(Oliv．)Diels)的干燥根。

黄嘌呤氧化酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，20100929);ALT(长春汇力生物技术有限公司，2010042)。

供试溶液的制备:黄药子、当归饮片，头煎10倍量水，浸泡2h后，煎煮1h，二煎8倍量水，煎煮1h，合并煎液，浓缩为含黄药子0.44g/ml;当归0.88g/ml。并分别以相同条件制备黄药子配伍当归水煎液，1∶2配伍组1.32g/ml。

乳酸钠林格氏液(天津市大冢制药有限公司，8J79C);1640(德国贝尔);医用氧气(纯度大于99%，黑龙江佳木斯医用气体公司);EDTA(上海华舜生物工程有限公司);磷酸二氢钾、硫酸镁、碳酸氢钠、葡萄糖(天津市凯通化学试剂有限公司，GR)。

1．2 实验动物

雄性SD大鼠，50只，体质量(250±20)g，由黑龙江中医药大学药物安全评价中心(GLP)提供，动物质量合格证书号:医动字第01－10－2号。

1．3 Krebs－Ringer灌流液的配制

取市售的乳酸钠林格氏液1000ml，加入碳酸氢钠2100.25mg、EDTA－Na2186.12mg、葡萄糖 2199.68mg、磷酸二氢钾163.31mg、硫酸镁295.78mg，超声溶解，即得，4℃保存，临用前预热至37℃。

1．4 仪器

恒流泵(河北保定兰格恒流泵有限公司BQ50－1J，泵头WX10);752型分光光度计(上海第二分析仪器厂);电子pH计(上海康仪仪器有限公司PHB－8型);水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司，DK－98－1型，加热功率500W加热温度37～100℃，波动度±5℃)。

1．5 统计学处理

2 方法与结果

2．1 最佳灌流条件考查

以经氧气饱和及加热至37℃的灌流液非循环性灌流冲洗肝脏中的血液。分别以不同流速进行灌流，同时测定流出液pH值及ALT酶活性。见表1、表2。

表1 不同流量下各灌流组流出液的pH值变化情况(±s)

表1 不同流量下各灌流组流出液的pH值变化情况(±s)

注:高流速组与中低流速组相比，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01。使用中低流速灌流过程中，pH值相对稳定，对肝组织内部结构基本无损伤。

时间n最高15' 5 7．51 ±0．01 7．52 ±0．02 7．02 ±0．02 7．05 ±0．03流量低中高30' 5 7．53 ±0．01 7．49 ±0．02 6．73 ±0．02* 6．55 ±0．00460' 5 7．53 ±0．01 7．49 ±0．01 6．56 ±0．02 6．00 ±0．0390' 5 7．44 ±0．01 7．45 ±0．02 6．04 ±0．02 5．57 ±0．06＊＊

表2 不同灌流速度下各组流出液中ALT酶活性(U/L，±s)

表2 不同灌流速度下各组流出液中ALT酶活性(U/L，±s)

注:各流速组相比，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01。以高流速灌流，在90分钟内，受试肝脏产生明显损害，差异有统计学意义。

组别90中 5 33．55 ±5．76 35．24 ±5．36 39．14 ±5．67 44．85 ±4．57高 5 41．24 ±3．67 51．94 ±4．67*65．24 ±7．67* 69．26 ±7．97*最高 5 52．49 ±3．81＊＊63．24 ±5．83＊＊67．34 ±8．97＊＊ 71．41 ±12．67 n15' 30' 60' 90'低 5 34．57 ±5．18 34．36 ±4．21 38．26 ±5．17 41．29 ±3．＊＊

灌流90min后，中流量组肝脏外观呈土黄色，颜色均一，质柔软，无肿胀且在整个灌流过程中流出液pH值保持相对恒定，最适宜肝灌流研究。

2．2 离体肝灌流

离体大鼠肝灌流模型建立参照丁选胜的方法［3］。

2．3 取样时间

给药前为 0，给药后 15'、30'、60'、90'分别取样0.5ml，立即补入相应剂量的1640灌流液。

2．4 黄嘌呤氧化酶(XOD)测定方法按试剂盒说明

取样品0．1ml，加入各种试剂，混匀，置37℃水浴20min，加终止液1mL，混匀，于530nm，1cm 光径，以蒸馏水调吸光度零点，用752分光光度计读取各管的OD值。

2．5 结果

2．5．1 黄药子单煎液对大鼠灌流肝脏XOD活性的影响

取大鼠30只，随机分为三组，分别为高剂量组(4．4mg/ml)、中剂量组(2．2mg/ml)、低剂量组(1.1mg/ml)。结果见表3。黄药子单煎组不同剂量下酶活性相比较，XOD活性差异显著，有统计学意义。黄药子单煎液在低剂量时即可产生肝毒性，随着作用时间的延长，损伤作用更加明显。

表3 黄药子单煎液对大鼠灌流肝脏XOD活性的影响(±s)

表3 黄药子单煎液对大鼠灌流肝脏XOD活性的影响(±s)

注:高、中、低各剂量组各时间点 XOD 活性比较，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01。

15' 30' 60' 90'低剂量 10 3．01 ±0．51 10．15 ±3．32 15．29 ±2．59 16．67 ±4．72 19．08 ±5．49组别n 0*中剂量 10 3．10 ±1．01 11．27 ±4．21 16．60 ±5．28 19．37 ±3．27 27．65 ±5．51＊＊高剂量 10 3．00 ±0．87 12．65 ±3．94 17．98 ±3．25 23．56 ±3．49 38．55 ±6．30＊＊

2．5．2 黄药子与当归配伍混煎液对大鼠灌流肝脏XOD活性的影响 结果见表4。

表4 配伍混煎液对大鼠灌流肝脏XOD活性的影响(±s)

表4 配伍混煎液对大鼠灌流肝脏XOD活性的影响(±s)

注:配伍组与空白组相比较，*P＞0．05;配伍组与黄药子组灌流30'－90'的酶活性比较，△P＜0．05;说明黄药子与当归1∶2为减毒最佳配伍比例，具有保护肝细胞、降低肝损伤的作用。

n15' 30' 60' 90'配伍组 10 7．34 ±3．87* 9．25 ±3．23 10．54 ±2．82 11．48 ±2．23组别△黄单组 1010．15 ±3．32 15．29 ±2．59 16．67 ±4．72 19．08 ±5．49△空白组 10 6．89 ±1．72* 6．96 ±1．91 6．99 ±3．31 6．87 ±4．18△

2．5．3 灌流肝脏病理组织切片的光学显微镜观察结果见图1。

图1 灌流肝脏HE染色光学显微镜图

由图可知，空白组肝细胞索排列整齐，胞质染色均一，中央静脉结构清晰;黄药子组肝细胞肿胀溶合、排列紊乱、肝板消失、细胞界限不清、细胞核固缩、胞浆染色不均一、汇管区空泡变，小胆管扩张、水肿、并有大量炎症细胞浸润和脂肪滴形成。配伍组肝板沿中央静脉辐射状排列，肝板与肝血窦较清晰，病变呈局灶性，肝细胞个别出现肿胀及炎细胞浸润。

3 讨论

黄嘌呤氧化酶(XOD)是体内核酸代谢中一种重要的酶，其广泛分布于心、肺、肝脏、小肠粘膜等组织细胞浆膜内，血清中的 XOD主要来自于肝细胞，可反映肝细胞损伤且有特异性诊断意义［4］。肝组织内氧自由基增加愈明显，XOD活性明显降低，脂质过氧化物生成明显增加，对肝组织的损伤也越重。

超氧阴离子自由基的生成与黄嘌呤氧化酶活性呈正相关，自由基的大量生成造成严重的氧化损伤。结合病理组织学，本研究结果表明，黄药子中含有损伤肝细胞提高XOD活性的化合物，打破了机体对自由基生成和消除的平衡，造成肝组织的受损和细胞毒作用;以1∶2进行黄药子与当归进行配伍使用时，具有显著降低XOD活性的作用［5］。

［1］ Trowell OA．The establishment and app lication of iso lated perfused rat liver preperation［J］．J Physiol(London)，1942，100:432．

［2］ Miller LL．Biological synthesis of serum protein by the iso lated perfused rat liver［J］．J Exp Med，1951，94:431．

［3］ 丁选胜，李欧．海藻甘草及其相配伍后的水提取物的肝毒性研究［J］．江苏中医药，2002，23(10):51－54．

［4］ 赵远红，邵凤珍．黄嘌呤氧化酶与肝病关系的探讨［J］．中西医结合肝病杂志，2005，15(3):188－190．

［5］ 于栋华．黄药子配伍当归的减毒及机理的研究［D］．哈尔滨:黑龙江中医药大学，2007:27－32．