非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝组织过氧化物酶体增殖物激活受体α mRNA表达及清热化湿法对其影响的实验研究

刘林，严红梅 ，张赤志

(1．湖北中医药大学，湖北 武汉 430061;2．武汉市第七医院，湖北 武汉 430064;3．湖北省中医院肝病中心，湖北 武汉 430061)

肝细胞脂肪变性、坏死和肝组织的炎症反应、肝纤维化是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的主要病理特征［1］。研究发现，过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARα)具有调节脂肪代谢和调节炎症、免疫以及细胞分化等作用，参与了NASH的发病机制［2］。笔者导师张赤志教授运用温病湿热证理论，结合NASH的发病机理和流行病学特点，选用清热化湿的代表性方剂王氏连朴饮加减治疗NASH，取得较好疗效。本研究旨在通过观察加减王氏连朴饮对NASH模型大鼠PPARα mRNA表达的影响，阐明清热化湿方防治NASH的作用机制，为本方在临床的广泛应用提供客观依据。

1 材料

1．1 药品 加减王氏连朴饮方组:黄连3g，厚朴6g，石菖蒲3g，法半夏3g，淡豆豉9g，炒栀子9g，丹参6g，赤芍6g组成，由湖北中医药大学国医堂制剂室制成水煎剂，浓缩、灭菌，1.2g/mL密封包装，置4℃冰箱保存备用，有效期1周。东宝肝泰(吉林通化东宝药业股份有限公司，批号040801)。

1．2 试剂 AST、ALT、TG，LDL试剂(南京建成生物工程研究所);PPARα原位杂交试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1．3 仪器 全自动生化检测仪(Olympus Au560，日本);台式高温低速离心机(Gentrifuge5471，德国);恒温箱(S648型，上海医疗器械厂);721分光光度计;恒温箱(S648型，上海医疗器械厂);图像分析系统(EagelII型，USA)。

1．4 动物 清洁级SD大鼠，40只，雌雄各半，体质量(170±20)g(湖北省医学实验动物中心)。

2 方法

2．1 动物分组

所有大鼠正常喂养1周，随机分为4组，每组10只:正常对照组(A组)、空白模型组(B组)、加减王氏连朴饮组(C组)、东宝肝泰对照组(D组)。

2．2 模型建立及给药

A组大鼠普通饲料正常喂养。B、C、D组参考钟岚等［3－4］报道的方法配成高脂饲料(在普通饲料基础上加10%猪油、2%胆固醇)复制大鼠NASH模型。给药8周后B、C、D组继续用高脂饲料喂养同时，B组予生理盐水10mL/kg/d灌胃，每日1次;C组予加减王氏连朴饮混悬液2.4g/kg/d灌胃(清热化湿方相当于成人常规剂量的1/35)，每日1次;D组予东宝肝泰混悬液0.09g/kg/d灌胃，每日1次。连续给药4周。

2．3 取材

A组大鼠普通饲料喂养12周。B、C、D组给药4周(即实验12周)，末次给药后，禁食12h，处死大鼠，迅速自眼眶静脉丛取血，常规分离血清。将肝脏4℃生理盐水冲洗，在最大叶距边缘5mm处取小块肝组织。

2．4 指标检测

2．4．1 血清生化测定 用Olympus Au560全自动生化分析仪检测血清TG、TCH、LDL、ALT、AST水平。

2．4．2 原位杂交技术检测肝组织PPARα mRNA的表达 将肝组织用含4%多聚甲醛/0.1M PBS(pH7.0－7.6，中含有1/1000 DEPC)缓冲液固定2～4h后，脱水制取石蜡切片，然后脱蜡至无水。将切片放入胃蛋白酶中，于37℃消化30min，放入用1%多聚甲醛/0.1M PBS(pH7.0～7.6，中含有1/1000 DEPC)室温固定10min。每张切片滴加20μl预杂交液于38～42℃置于湿盒2h，每张切片滴加20μl PPARα寡核甘酸探针杂交液于38～42℃在恒温箱中杂交过夜。取出切片反复洗涤，滴加封闭液37℃30min，将切片与生物素化地高辛抗体37℃温育30min。滴加SABC室温30min，滴加生物素化过氧化物酶室温30min，DAB显色，苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透明，封片。显微镜下观察显色结果及扫描记录。每张切片随机选择5个高倍(10×40)视野，每一视野经图像分析系统读取吸光度，将平均每视野的吸光度作为该标本切片的代表值(MOD)，再计算出各组的均数。

PPARα寡核甘酸探针序列(靶基因 mRNA序列):

5'—AAGAGATGGGAAACATTCAAGAGAT TTCTC AGTCC—3'

5'—AGCTGTCCAGGCTCGGAGGGCTCTG TCATC ACAGA—3'

5'—ACCAG TACAG ATGAG TCCCC TGGCA ATGCA CTGAA—3'

3 结果

3．1 各组大鼠血脂和肝功能的比较 与模型组相比，东宝肝泰能明显降低 NASH大鼠的 TG，TCH水平(P＜0.05)。加减王氏连朴饮组大鼠血清TG，TCH，ALT，AST明显降低(P＜0.01)，作用优于东宝肝泰组(P＜0.05)。结果见表1。

表1 各组大鼠血脂和肝功能的比较(±s)

表1 各组大鼠血脂和肝功能的比较(±s)

注:与空白模型组比较，1)P ＜0．05，2)P ＜0．01;与东宝肝泰对照组比较，3)P ＜0．05。

组别 nTG(mmol/L)TCH(mmol/L)LDL(mmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)正常对照组 10 0．25 ±0．014 1．48 ±0．15 0．19 ±0．020 67．55 ±25．02 66．73 ±30．23空白模型组 10 0．43 ±0．040 4．63 ±0．52 1．30 ±0．056 145．78 ±38．67 149．82 ±38．03加减王氏连朴饮组 10 0．30 ±0．0352，3) 3．08 ±0．642，3) 0．80 ±0．0532，3) 105．36 ±34．022，3) 110．53 ±37．652，3)东宝肝泰对照组 10 0．34 ±0．0331) 3．85 ±0．701) 0．86 ±0．0561) 138．30 ±27．671) 145．25 ±36．051)

3．2 PPARα mRNA 表达

原位杂交切片光镜下观察:各组大鼠肝组织切片PPARα mRNA皆有表达，于胞浆内弥散分布(图1)，正常组表达最明显。图像分析结果见表2。

表2 各组大鼠肝组织PPARα mRNA表达的比较(±s)

表2 各组大鼠肝组织PPARα mRNA表达的比较(±s)

注:与空白模型组比较1)P＜0.01;与东宝肝泰组比较，2)P＞0.05。

组别 nPPARα mRNA表达(MOD)正常对照组10 0．0453 ±0．0045空白模型组 10 0．0256 ±0．0032加减王氏连朴饮组 10 0．0375 ±0．00401，2)*东宝肝泰对照组10 0．0343 ±0．0038

图1 各组大鼠肝组织PPARα mRNA原位杂交染色

4 讨论

过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)是一类由配体激活的核转录因子，有 PPARα、β(或 δ)和 γ3种亚型［5］，是调节脂质代谢、胰岛素敏感性、炎症反应、细胞生长和分化的重要因子［6］。PPARα主要分布于与脂肪酸代谢密切相关的组织如肝脏、肾脏、心脏、肌肉等，PPARα可通过3种机制调节脂肪代谢，通过与配体结合后活化而发挥作用。和配体结合后被激活的PPARα和视黄醇X受体(retinoid X receptor，RXR)形成异二聚体，再与靶基因启动区域的过氧化物增殖反应元件(proxisome proliferator response element，PPRE)结合发挥转录调控作用［7］。目前认为，PPARα在脂质代谢中起着重要调节作用。PPARα不仅能诱导线粒体、过氧化物酶体及微粒体氧化酶体的产生，还能促使参与脂肪重新合成及与糖异生相关的酶的生成，从而加速肝脏脂肪酸的氧化，减少肝脏脂肪酸的含量［8－9］。PPARα 缺乏不仅加重 TG 在肝脏的沉积，还可引起脂质和碳水化合物的代谢紊乱。PPARα表达减少可导致与脂质代谢相关的酶基因转录水平降低，致使脂肪酸在肝脏氧化减少，加速脂质在肝脏沉积，从而促发 NASH 的发生发展［10－11］

笔者实验证实，NASH模型组大鼠肝组织PPARα mRNA表达明显减弱(P＜0.01)，血清 TG、TCH、LDL、ALT、AST水平却明显高于正常，表明PPARα的减少导致肝内脂肪酸代谢失衡，引起肝内脂质堆积，这可能是NASH发生的原因之一。与空白模型组相比，加减王氏连朴饮组血清TG、TCH、LDL、ALT、AST明显降低(P＜0.01)，脂肪变性和炎症活动程度明显改善(P＜0.01)，大鼠肝组织PPARα mRNA表达明显增强(P＜0.05)，提示加减王氏连朴饮可能通过激活 PPARα mRNA表达来调节脂质代谢及其他功能发挥防治NASH的作用。

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