氯化锂对人骨肉瘤细胞U2-OS增殖、凋亡及Fas、Caspase-3 mRNA表达的影响

赵意华，陈清汉 ，华海婴，姜玉军，秦建英，任明明

1)郑州大学第二附属医院骨科 郑州450014 2)郑州大学医药科学研究院 郑州450052

#通讯作者，男，1963年5月生，硕士，教授，研究方向:骨科疾病的基础与临床，E-mail:chenqinghan833@medmail.com.cn

骨肉瘤是一种起源于间叶组织的恶性肿瘤，好发于儿童和青少年股骨远端、胫骨近端，易转移至肺、脑等组织［1］，因而愈后较差。研究［2］表明，其发生机制主要与原癌基因激活和抑癌基因失活有关。目前临床治疗方法以手术结合多种药物化疗［3］为主，但常用化疗药物如顺铂(PDD)、大剂量环磷酰胺(HDMTX)长期应用副作用较大，效果不理想。锂是一种人体非必需微量元素，具有免疫调节作用，并在体内外具有广谱抗肿瘤作用; 其化合物氯化锂(LiCl)在体外可抑制多种肿瘤细胞增殖并诱导凋亡［4］。目前，LiCl 对人骨肉瘤细胞系(U2-OS)作用的研究尚未见文献报道。作者观察了LiCl 在体外对U2-OS 细胞增殖、凋亡及Fas、Caspase-3 mRNA 表达的影响，探讨其可能的作用机制，为骨肉瘤的药物治疗寻求新的途径。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器 U2-OS、LiCl、细胞凋亡及细胞周期检测试剂盒(郑州创生生物公司)，DMEM 培养基(Gibco 公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，胰蛋白酶、MTT(Sigma 公司)，酶标仪(Thermo 公司)，流式细胞仪(Benekman 公司)。以GAPDH 为内参照。精密称取1.695 g LiCl 溶于20 mL 三蒸水中，配制成2.0 mol/L 母液，过滤后4℃保存备用，临用时加入培养基稀释至终浓度。

1.2 细胞培养 U2-OS 细胞贴壁生长于含体积分数10%胎牛血清的DMEM 培养基中，置于37℃、体积分数5% CO2培养箱中培养，2～3 d 传代1 次。

1.3 实验分组 取对数生长期U2-OS 细胞，胰酶消化后调整细胞浓度为1.0×105mL－1，接种于培养板内，置于37℃、体积分数5% CO2培养箱中培养，24 h 后弃去旧液，分组培养，每组设5 个平行孔。正常对照组用等容积培养液培养，阳性对照组加用15 mg/L 5-FU，药物组分别加入40、80、150 mmol/L LiCl 溶液。

1.4 观测指标

1.4.1 细胞增殖抑制率 细胞分别培养24、48 和72 h 后，加MTT(5 mg/L)20 μL，培养4 h 后弃去培养液，加200 μL DMSO，待结晶颗粒充分溶解后，在酶标仪490 nm 处测定吸光度(A)，根据公式计算细胞增殖抑制率:增殖抑制率=(1 －实验组A/对照组A)×100%。

1.4.2 凋亡和细胞周期 取各组细胞接种于6 孔板内培养，48 h 后收集细胞于1.5 mL EP 管内，加500 μL Annexin-binding Buffer 重悬细胞并调整浓度为(1.0～5.0)×106mL－1，加Annexin V-FITC 5 μL、PI 10 μL，避光染色5 min 后，上流式细胞仪检测凋亡;加PI(50 mg/L)1 mL，4℃避光染色30 min，上流式细胞仪进行细胞周期分析。

1.4.3 Fas、Caspase-3 mRNA 检测 各组细胞培养24 h 后用PBS 清洗，之后冰上操作，Trizol 法提取RNA，按照试剂盒说明进行逆转录，取逆转录产物行PCR 扩增。PCR 引物由上海生工生物工程公司合成。Fas 后引物序列5’-GCCACCCCAAGTAGATCT GG-3’，前引物序列 5’-ACTGTGACCCTTGCAC CAAAT-3’; Caspase-3 后引物序列5’-GCATACT GTTTCAGCATGGCAC-3 ’，前引物序列 5 ’-CAAACTTTTTCAGAGGGGATCG-3’。PCR 反应条件:预变性94℃(GAPDH)或98℃(Caspase-3 和Fas)5 min; 变性94℃30 s，退火58℃(GAPDH)或54℃(Caspase-3)或59℃(Fas)30 s，延伸72℃45 s，总循环35 次(GAPDH)或34 次(Fas 和Caspase-3)。反应结束后取PCR 产物5 μL，行琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像分析系统进行扫描，以目的条带与GAPDH 条带灰度值的比值表示目的基因mRNA的相对表达量。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0 处理数据，应用单因素方差分析比较各组细胞增殖抑制率、细胞周期、凋亡率及Fas、Caspase-3 mRNA 相对表达量，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 LiCl 对U2-OS 细胞增殖的影响 增殖抑制率测定结果见表1。

表1 5组增殖抑制率测定结果(n=5)%

2.2 LiCl 对U2-OS 细胞周期和凋亡的影响 结果见表2。

2.3 LiCL 对U2-OS 细胞中Fas、Caspase-3 mRNA 表达的影响 结果见表3。

表2 4组U2-OS 细胞的细胞周期和凋亡率(n=5)

表3 4组Fas 和Caspase-3 mRNA 的相对表达量(n=3)

3 讨论

研究［5-6］发现，骨肉瘤的发生发展涉及细胞内许多基因的改变，而某些基因的表达在促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤生长方面具有重要意义［7-8］，其中Fas/FasL 和Caspase 系统在细胞凋亡过程中起重要作用。Fas 基因作为重要的凋亡调控基因，位于人类染色体10q，其编码产物相对分子质量约为45 000，是一种Ⅰ型跨膜受体蛋白，属于肿瘤坏死因子/神经生长因子(TNF/NGF)受体超家族，该蛋白是诱导细胞程序性死亡的信号分子［9］，在正常细胞内可通过信号传导途径逐级放大死亡信号，通过相应受体传导至细胞核内部，引起核内转录基因的改变，从而启动凋亡程序。FasL 基因位于染色体1q23［10］，主要分布于活化的T 细胞和NK 细胞，其编码产物相对分子质量为31 000，为Ⅱ型跨膜蛋白，属于TNF 家族，可与其配体Fas 蛋白特异性结合，形成配体受体复合体，将细胞外的凋亡信号转导至细胞内部。Caspase 是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶［11］，是由Caspase 基因家族转录表达的一类具有酶切作用的蛋白质，目前已发现14 种［12］，其中Caspase-3 是主要的凋亡执行蛋白，在被上游分子激活后能分解细胞骨架蛋白、细胞器等结构，参与细胞凋亡的具体执行过程［13］。Fas、FasL 和Caspase 家族在细胞凋亡过程中分别起着发出凋亡死亡信号、感知并转导信号且逐级放大至细胞内部、接受信号激活级联反应并产生效应等一系列作用。此系统是细胞凋亡的最主要途径之一，其中Caspase 蛋白的表达是各种细胞凋亡机制的最后共同通路，在细胞的信号传递过程中处于重要地位［14］。

该研究结果显示，LiCl 对体外培养的U2-OS 细胞具有显著的增殖抑制作用和凋亡诱导作用，且上述作用表现出剂量依赖性;细胞周期测定结果显示，LiCl 可使U2-OS 细胞G1期细胞百分比下降，S 期细胞百分比则增高，且二倍体峰值随药物剂量增大呈下降趋势，表明细胞被阻滞于S 期。以上结果初步证实LiCl 有抑制骨肉瘤细胞生长，促进凋亡的作用。进一步的检测结果显示，LiCl 作用后，U2-OS 细胞中Fas 和caspase-3 mRNA 的表达水平异常增高。因此，作者认为，LiCl 可促进U2-OS 细胞的凋亡，抑制其生长，上调促凋亡基因Fas 的表达，而Fas/FasL和Caspase 介导的死亡信号转导系统则可能是其作用机制之一。

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