槟榔江水牛STAT5A基因多态性及MspI PCR－RFLP遗传标记的建立

季 敏，余长林，余选富，刘定江，刘学洪，史宪伟＊

（1.云南农业大学动物科学技术学院，云南 昆明650201；2.云南省腾冲县畜牧工作站，云南 腾冲679100）

STAT（Signal transducer and activator of transcription，信号转导及转录激活因子）是一族蛋白质，包括STAT1，2，3，4，5A，5B，6共7个成员，它们主要介导若干激素和细胞因子的活动［1］。STAT5A基因位于牛的19号染色体上［2］，作为乳腺调控因子主要调控靶基因中催乳素和生长激素的活动［3，4］，Ball与Lee的研究已经证明乳蛋白基因的表达受催乳素与肾上腺皮质激素的协同调控［5，6］，Bauman等证明注射生长激素对奶牛的产奶量有提高作用［7］。因此，STAT5A基因可以作为一个与泌乳有关的候选数量性状位点。国外对牛STAT5A基因的研究报道较多，而在水牛上还未见报道。Flisikowski等对不同牛种进行了STAT5A基因外显子7单核苷酸多态性的研究，结果在STAT5A基因外显子7检测到1个SSCP位点，6种基因型［8］。Selvaggi运用PCR－RFLP（AvaI酶切）技术在意大利布朗牛STAT5A基因外显子7第6853位置发现了一个C／T碱基替换，且CC和CT基因型与产奶量，乳蛋白含量和乳脂含量有非常明显的相关性。CC基因型比CT基因型产奶量高，CC基因型乳蛋白质含量也高于CT基因型，但乳脂含量没有明显的差异［9］。Brym在荷斯坦和新泽西州牛的STAT5A基因内含子9第9501位置处发现一个新的SNP（A／G）。对荷斯坦牛来说，不同的基因型与泌乳性状之间没有明显的相关性，但在新泽西牛中，不同基因型与头胎次和二胎次泌乳量，乳蛋白率和乳脂率之间存在着明显的相关性，GG型牛有高产奶量，而AA和AG型牛蛋白质产量高［10］。鲍斌等在中国荷斯坦牛STAT5A基因内含子9第9501位置也发现了A／G突变［11］。

槟榔江水牛是迄今为止在我国发现的惟一的河流型水牛，主要分布在云南省腾冲县槟榔江流域，已有500余年的饲养历史［12］。2008年7月11日通过了国家畜禽遗传资源委员会鉴定，其乳用性能较好，是发展中国水牛乳业和云南特色畜牧业的宝贵种质资源［13］。所以对槟榔江水牛的研究有着重要的意义。近年来随着分子生物学技术的发展，以PCR为基础的PCR－RFLP和以DNA测序为核心的分子标记技术对特定基因的多态性研究已经很成熟，本文利用PCR－RFLP和测序技术研究了STAT5A基因多态性，为今后探讨STAT5A基因对槟榔江水牛泌乳性状的影响以及良种水牛的保种选育提供了一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

66头槟榔江水牛来自云南省腾冲县巴福乐槟榔江水牛良种繁育公司。采其耳朵组织，浸泡于无水酒精中于－20℃保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的提取 采用传统的苯酚／氯仿抽提法。TE溶解，－20℃保存备用。

1.2.2 引物合成 根据NCBI上提供的牛（Bos taurus）的STAT5A基因序列（Gene bank登录号：NW＿003104496.1），利用primer3在线设计3对引物P1，P2，P3，引物由上海生工生物工程公司合成。引物序列、PCR产物大小见表1，引物扩增区域详见图1。

表1 引物P1，P2，P3的DNA序列，扩增区域和扩增产物长度

图1 STAT5A基因结构和引物位置分布图

1.2.3 PCR体系与条件 PCR反应体系为50 μL：10×Buffer 5μL（含 Mg2＋），上、下游引物（10 μmmol／L）各1.5μL ，dNTPs（2.0mmol／L）1μL，Taq DNA聚合酶0.4μL，DNA 4μL （约50ng），dH2O补至50μL。扩增程序：94℃预变性2min→10个循环（94℃变性45s→65℃，退火45s，每个循环递减1℃→72℃延伸2min）→30个循环（94℃变性45s→56℃，退火45s，72℃延伸2min）→72℃后延伸8min，4℃保存。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶（溴化乙啶染色），电泳检测。

1.2.4 测序 PCR扩增产物送上海立菲生物技术有限公司进行双向测序，测序采用ABI3730xl测序仪及配套的BigDye Terminator试剂盒。

1.2.5 PCR－RFLP 酶切反应体系为20μL：10×酶解缓冲液2μL，MspI（20I／μL）0.5μL，4μL PCR产物，加水至20μL，37℃水浴4h以上。用1.0%的琼脂糖凝胶（溴化乙啶染色）电泳检测。

1.2.6 序列分析及数据分析 应用DNAstar软件包对测序结果进行比对分析。等位基因频率、基因型频率及Hardy－Weinberg遗传平衡分析采用excel及SPSS 16.0进行。

2 结果与分析

2.1 槟榔江水牛STAT5A基因PCR扩增结果

扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明，PCR扩增产物电泳条带清晰，产物片段大小与预期片段大小相符，特异性良好，可用于测序和酶切反应。电泳检测结果见图2和图3。

2.2 测序结果及SNP分析

为了检测槟榔江水牛STAT5A基因多态性，我们选择了8个水牛个体进行正反双向测序。通过对所有测序结果进行分析，共发现38个变异位点。其中引物P1扩增产物片段发现24个变异位点，引物P2扩增片段发现11个变异位点，引物P3扩增产物发现3个变异位点。所检测到的所有变异位点均为单核苷酸变异（SNP），未发现碱基插入或缺失。其中外显子8产生2处C924T，C975T突变，氨基酸分析表明，没有导致308位氨基酸（脯氨酸）和325位氨基酸（丝氨酸）的变化；外显子13产生2处G1482A，C1548T突变，没有导致494位氨基酸（脯氨酸）和516位氨基酸（丙氨酸）的变化。检测到的 所有SNP位点信息见表2。

图2 引物P1PCR扩增产物电泳结果

图3 引物P2，P3PCR扩增产物电泳结果

表2 槟榔江水牛STAT5A基因SNP位点

2.3 PCR－RFLP结果

通过对引物P3扩增片段测序结果进行分析，发现在内含子15中一个C→T碱基替换产生了一个MspI限制性内切酶位点，因此我们建立了MspI酶切位点的PCR－RFLP分子标记技术。该变异位点序列见图4。用MspI限制性内切酶对全部66个样品进行酶切反应，得到的结果见图5与表3。

图4 槟榔江水牛STAT5A基因内含子15的一个变异位点序列

图5 引物P3扩增产物MspI酶切结果

表3 引物P3扩增产物PCR－RFLP检测到的基因型频率和等位基因频率

槟榔江水牛MspI酶切位点由C和G两个等位基因控制，酶切得到三种基因型，分别为CC，CG，GG。基因型为CC的片段被切成452bp和330bp两条带；杂合子CG为782bp，452bp和330bp三条带；基因型为GG的片段只有一条782bp的条带，未被切开。通过计算发现，CG为优势基因型，C为优势基因，等位基因C的频率明显高于等位基因G的频率。经χ2适合性检验，槟榔江水牛MspI酶切位点的χ2值为0.546，差异水平不显著（P＞0.05），说明槟榔江水牛在MspI酶切位点上处于Hardy－Weinberg平衡。

2.4 基因频率

对全部66个样品用引物P1进行扩增并全部测序。通过对测序结果进行分析，共发现24个变异位点。各变异位点的等位基因频率和基因型频率见表4。

表4 引物P1扩增产物变异位点的等位基因频率和基因型频率

经χ2适合性检验可得，全部24个变异位点中有21个位点差异不显著，达到了Hardy－Weinberg平衡，有3个位点差异显著，偏离Hardy－Weinberg平衡。

3 讨论

在奶牛辅助标记选择中提出了很多基因作为潜在的候选基因，STAT5A因为在催乳素和生长激素的信号转导中发挥重要作用而成为候选基因之一。在STAT5A基因中发现的核苷酸多态性尤其是单核苷酸多态性与奶牛的泌乳性状如产奶量，乳蛋白率和乳脂率有关联。在牛STAT5A基因中已检测到许多核苷酸多态性。Khatib等人在奶牛STAT5A基因外显子8中发现一个SNP位点是G／C碱基替换［14］；McCracken 等人［15］在STAT5A基因内含子12中发现了不同长度的TG重复；Flisikowski等人在牛内含子15中发现CCT缺失，而在外显子16中发现一个T／C突变，该突变导致686位的氨基酸由缬氨酸变为丙氨酸［16，17］；Flisikowski等人还在STAT5A基因的启动子区发现2个SNP位点，分别是－247A／G替换 和－226G／A替换，经PCR－RFLP分析，这两个变异位点存在SgrAI或者Sma I酶切位点［18］。

本研究在槟榔江水牛STAT5A基因中共发现38个SNP变异位点，没有发现碱基插入或缺失变异。其中内含子中发现34个变异位点，外显子中有4个。腾冲县位于云南省保山市西南部，西部与缅甸毗邻，历史上曾是古西南丝绸之路的要冲，腾冲县的地理位置决定了槟榔江水牛与亚洲其他水牛种群之间的交流十分频繁，特别是与国内外沼泽型水牛杂交繁殖，导致槟榔江水牛的遗传变异十分丰富。其中外显子8中的两个SNP位点都是C／T碱基替换，外显子13中有2个SNP位点，分别是G／A变异和C／T变异。外显子中的4个变异都是同义突变，没有引起氨基酸的变化。槟榔江水牛内含子15的1个C／T碱基的替换产生了一个MspI酶切位点，经χ2检验该酶切位点达到了Hardy－Weinberg平衡，这说明在此位点的基因型频率和基因频率将稳定遗传，处于遗传平衡状态。酶切结果显示，该酶切位点CG基因型频率（0.485）高于CC和GG基因型频率（0.424，0.091），说明在此位点杂合子是优势基因型。在特定的条件下杂合子个体可能比正常纯合子个体更有利于生存和繁殖后代。因此在大规模群体检测中此位点可以作为一个快速简便的遗传标记。对引物P1扩增区域进行群体遗传学分析表明，全部24个变异位点中有21个处于Hardy－Weinberg平衡状态，只有3个位点偏离Hardy－Weinberg平衡状态（P＜0.05）。偏离 Hardy－Weinberg平衡状态的SNP是由于样本数量有限还是与选种选育引起的遗传漂变有关有待于进一步研究。

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