酸奶在贮存过程中脂肪酸含量的变化

李云龙，甘宗辉，冀德君，王小龙，常玲玲，刘 姗，刘贤慧，杨章平

引言

饮用酸牛奶一直被认为是对人体健康有益。保加利亚人的长寿可能由于其经常食用酸奶［1］。此外，流行病学［2］和动物实验研究［3］表明，饮用乳酸菌发酵奶生产的产品，可以减少多种肿瘤的发生率。乳酸菌会增加人体肠道的酸性环境，从而改变肠道菌群，减少致突变化合物的生产，而且可以通过附着在细菌的表面将有毒有害物质排泄出体外［4，5］。

在发酵过程中，会形成许多具有生物活性的物质［6］，如一些有机酸（乳酸，丙酮酸，甲酸，乙酸和丙酸），蛋白质水解还会产生一些生物多肽［7］，通过碳水化合物的降解可以产生乙醛，丙酮，羟丁酸和双乙酰［8］。共轭亚油酸（CLA）的含量还可以通过乳酸菌和其他一些细菌的生物还原作用由亚油酸还原生成［11］。

自20世纪60年代起，细菌就被证明可以合成共轭亚油酸［12］。例如，丙酸杆菌［11］，对一些乳酸菌和酸奶发酵剂［14，15］的研究表明：其在奶制品中具有促进CLA生成的潜力。培养基中底物的浓度水平对CLA的产生是一个关键因素，因为高水平的长链不饱和脂肪酸（LCFA）被认为可以抑制细胞的生长，并影响整个氢化的步骤［16］。

由于乳制品中脂肪酸含量的变化，会影响产品的风味和营养成分，所以有必要研究酸奶中各种脂肪酸的变化情况，到目前为止，国内外对酸奶中脂肪酸的变化情况研究的还很少，本研究的目的是分析酸奶在制作后和贮存过程中脂肪酸变化情况，为酸奶的制作和贮存提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料奶

原料奶采自扬州大学实验农牧场当天生产的混合奶样，在4℃条件下保存，防止变质，取一部分原料奶将其分为3个平行样品，直接检测其脂肪酸组成，余下的原料奶用于制作酸奶。

1.2 菌种的来源与复壮

制作酸奶所用的发酵剂为扬州大学旅游烹饪学院重点实验室自己培养并生产的冻干粉发酵剂，该发酵剂由保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌按照1∶1的比例制成的混合菌种发酵剂，在制作酸奶之前，先将冻干粉发酵剂接种于脱脂乳中，在培养箱中进行培养，并传代2～3代，使发酵剂的活力增强。

1.3 酸奶的制作

将15kg鲜牛奶和900g蔗糖混匀，平均分装3份，然后在65℃水浴锅中预热，边加热边搅拌，让蔗糖充分溶解，用纱布过滤牛奶，除去其中的较大颗粒杂质，使用均质机在15MPa的压力下对牛奶进行均质，然后在水浴锅中将牛奶加热到95℃，并保温5min，加热结束后将牛奶放置在冰水中迅速冷却，当温度降至45～46℃时，在超净台的无菌环境中分别接种体积分数2%、3%和4%的乳酸菌，每一不同接种量的牛奶分装在15个小的锥形瓶内，放在42℃培养箱中发酵，经过3～4h的发酵，待牛奶完全凝固后取出放入4℃冰箱中过夜，使酸奶后熟。将成熟后的酸奶放在4℃冰箱中继续保存。在酸奶成熟后和贮存的第2d、第4d、第6d、第8d时分别拿出3个平行样品检测其乳酸菌含量和脂肪酸比例。

1.4 酸奶中脂肪酸的检测

脂肪酸的前处理方法参照国标GB／T21676－2008《乳与乳制品脂肪酸的测定 气相色谱法》［9］，选用Agilent HP－88专用脂肪酸甲酯毛细管柱，37种脂肪酸甲酯混标样购自美国Sigma公司，c9，t11 CLA甲酯和t10，c12CLA甲酯购自美国Matreya公司，采用程序升温的步骤：初始温度140℃，保持5min，以6℃／min升温到200℃，保持20min，再以2℃／min升温到220℃，保持20min。

1.5 酸奶中乳酸菌数的检测

参照国标GB4789.35－2010《食品微生物学检验乳酸菌检验》［10］。

1.6 统计分析

脂肪酸组分以保留时间定性，以面积百分比法定量。

Ai%＝×100%Ai表示第i个组分的峰面积，Ai表示所有组分的所有峰面积之和。脂肪酸的数据采用SAS软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同接种量酸奶的乳酸菌数变化

接种量2%、3%和4%的酸奶在贮存期间，乳酸菌含量都呈现下降的趋势（表1），接种量2%的酸奶在立即测定（发酵成熟后）和贮存的第4d时乳酸菌含量显著高于第8d含量（P＜0.05）。第2d的含量极显著高于第8d含量（P＜0.01）。接种量3%的酸奶在立即测定和贮存的第2d、第4d时乳酸菌含量极显著高于第6d和第8d的含量（P＜0.01）。接种量4%的酸奶在立即测定时的乳酸菌含量显著高于第2d的含量，并且极显著高于第4d、第6d和第8d的含量。

表1 不同接种量酸奶贮存期间乳酸菌含量（M±SD）

2.2 不同接种量的酸奶在发酵成熟后脂肪酸的变化

由表2可知酸奶发酵成熟后短链脂肪酸（碳原子数≤8）显著增加了，3%接种量的酸奶短链脂肪酸增加的最多，其中C4∶0、C6∶0和C8∶0的含量在3%接种量的酸奶中显著（P＜0.05）和极显著（P＜0.01）高于原料奶和其他接种量的酸奶。对于可引发人类高胆固醇水平，心血管疾病、肥胖和肿瘤等疾病的中链脂肪酸酸奶（8＜碳原子数＜16）的含量均较原料奶有所降低，3%接种量的酸奶降低的最多，其中C14∶0、C14∶1、C16∶0和C16∶1的含量均显著（P＜0.05）和极显著（P＜0.01）低于原料奶和其他接种量的酸奶。经乳酸菌发酵后，长链不饱和脂肪酸（碳原子数≥16）C18∶3、C20∶4和C22∶6的含量在3种不同接种量的酸奶和原料奶之间存在显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）的差异。CLA中c9t11CLA的含量在酸奶中均显著高于原料奶（P＜0.05），t10c12CLA的含量无显著变化。总体来看，3%接种量的酸奶在单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的总量上均显著（P＜0.05）和极显著（P＜0.01）高于原料奶，而2%接种量的酸奶和4%接种量的酸奶在多不饱和脂肪酸的总量显著（P＜0.05）高于原料奶。

表2 不同接种量酸奶发酵成熟后脂肪酸含量变化（M±SD）

2.3 不同接种量的酸奶在贮存期间脂肪酸的变化

由表3、表4和表5可知，2%、3%和4%接种量的酸奶在贮存期间脂肪酸稍有变化，但都没有达到显著的水平，短链脂肪酸呈进一步增加的趋势，长链脂肪酸特别是长链不饱和脂肪酸则呈现下降，而中链脂肪酸变化不明显。

3 讨论

3.1 酸奶制作后脂肪酸的变化

本实验的研究结果发现2%、3%和4%接种量的酸奶短链脂肪酸（SCFA）含量均有明显的增加。而中链脂肪酸C14∶0、C14∶1、C16∶0和C16∶1在酸奶中的含量均比原料奶低，主要的原因是乳酸菌的脂肪酶的水解作用造成的，乳酸菌的脂肪酶具有能水解甘油一酯，甘油二酯和甘油三酯的酶活性［17］。脂肪酶的活性取决于乳酸菌的种类，并且对温度和钙、镁离子的敏感。牛奶中脂肪的降解和乳酸菌脂肪酶的活性紧密相关，也和牛奶中脂肪酸的含量，脂肪酸与酶的接触程度有关。与脂肪酸分解相关的另一个很重要的原因是牛奶发酵前的预处理，因为所有的技术处理包括冷却、均质和搅拌，都会对牛奶脂肪球膜造成破坏而导致牛奶脂肪酸的分解［18］。这些短链脂肪酸都结合在三酰基甘油的SN－3的位置，而这些位置很容易受到乳酸菌脂肪酶的分解作用。乳酸菌的脂肪酶对短链脂肪酸还表现出底物特异性，进一步促进了短链脂肪酸的生成［19］。Tamime和 Robinson［20］报告，牛奶接种混合菌种发酵剂比单一菌种发酵剂产生更多的短链脂肪酸。推测可能的原因是菌种之间的相互刺激和协同的作用。本实验所采用的是保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的混合菌种发酵剂，所产生的大量短链脂肪酸与Tamime等的报道相一致。

表3 接种量2%的酸奶贮存期间脂肪酸变化（M±SD）

长链不饱和脂肪酸C18∶3、C20∶4、C22∶6和c9t11CLA在3种不同接种量的酸奶发酵成熟后立即测定时的含量均显著高于原料奶中的含量（P＜0.05），Rao等［21］报道，牛奶经过嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌发酵后，长链脂肪酸有所增加，可能的原因是乳酸菌自身生长合成并分泌到牛奶中的长链不饱和脂肪酸，因为牛奶中这些长链不饱和脂肪酸含量本身不多，细菌所产生的量足以引起显著的变化。

本研究发现，酸奶在发酵成熟后CLA中c9t11CLA的含量显著高于原料奶（P＜0.05），t10c12CLA的含量无显著变化，这与Floernce等［22］的研究结果一致。细菌的菌株能够产生共轭亚油酸这一事实早在20世纪60年代就已经被发现［12］。例如，丙酸杆菌和一些乳酸菌都可以用来生产富含CLA乳制品的有机体［13，15］。Oliveira［23］在其研究中发现，添加 了益生菌的发酵牛奶可以增加CLA的含量，进一步证实了一些细菌可以自行产生CLA的能力。

Lin等［24］在牛奶中分别接种嗜酸乳杆菌和双歧杆菌两种不同的益生菌，结果牛奶中CLA含量有所差异，表明不同的细菌生产CLA的能力有所不同。本实验中发现一个特别的现象，3%接种量的酸奶在脂肪酸的变化上最为明显，短链脂肪酸的增加和部分中链脂肪酸的减少，以及长链不饱和脂肪酸的增加在不同接种量的酸奶中是最多的，4%接种量的酸奶脂肪酸的变化介于2%和3%接种量酸奶之间，提示3%接种量的酸奶在生产实际中最为有效，对人体的健康也最为有利。4%接种量的酸奶没有像预期中的一样，比3%接种量的酸奶脂肪酸变化明显，可能的原因是乳酸菌相互竞争有限的资源，反而起到相互抑制的作用，在表1中可以看出，4%接种量的酸奶中乳酸菌数并没有得到显著的增加。

表4 接种量3%的酸奶贮存期间脂肪酸变化规律（M±SD）

3.2 酸奶在贮存期间的脂肪酸变化

本实验的研究发现，2%、3%和4%的酸奶在贮存期间脂肪酸均没有显著性变化，短链脂肪酸在贮存期间含量进一步增加，长链脂肪酸呈下降的趋势，而中链脂肪酸变化无规律。Regula［17］等在研究了四种发酵乳饮料（酸奶、活性乳、酸牛奶、开菲尔）时得出了与本研究同样的结论。Guler［25］等用山羊奶和绵羊奶为原料制作酸奶，并在贮存的第1d，第7 d，第14d和第21d检测发酵乳中脂肪酸的变化情况，结果表明短链脂肪酸在贮藏期间增加、中链脂肪酸和长链脂肪酸在贮藏期间减少，均达到显著水平，Guler推测可能的原因是双歧杆菌自身的代谢造成的结果，本研究在3种脂肪酸的含量上没有发现显著性变化，与Guler的研究存在差异，可能的原因是原料乳的差异和发酵剂菌种的差异造成的。

表5 接种量4%的酸奶贮存期间脂肪酸变化规律（M±SD）

4 结论

本实验对2%、3%和4%的不同接种量的酸奶发酵成熟后和贮存期间的脂肪酸组分进行研究，结果表明：3%接种量的酸奶变化最为明显，3种不同接种量的酸奶在贮存期间脂肪酸变化不显著。

［1］李文美.酸牛奶对人们健康长寿的主要作用［J］.中国奶牛，1994，2：53.

［2］魏 华，刘春梅，程波财，等.益生菌活菌与死菌的保健作用研究进展［J］.食品科学，2007，28（11）：618－623.

［3］McCarthy A C，La E，Conti C J，etal.Effect of spray－dried yo－gurt and lactic acid bacteria on the initiation and promotion stages of chemically induced skin carcinogenesis in mice［J］.Nutr Cancer，1997，27，231－237.

［4］韩文瑜，孙长江.抗菌肽的研究现状与展望［J］.中国兽药杂志，2009，43（10）：11－19.

［5］张 健.酸奶品种以酸奶的好处［J］.农产品加工，2009，9：64.

［6］Vasiljevic T，Shah N P.Probiotics－from Metchnikoff to bioactives［J］.Int.Dairy J.，2008，18，714－728.

［7］Gobbetti M，Minervini F，Rizzello C G.Angiontensin I－convertin－enzyme－inhibitory and antimicrobial bioactive peptides［J］.Int.J.Dairy Tech.，2004，57，173－187.

［8］Izco J M，Tormo M，Jiménez－Flores R.Rapid simultaneous determination of organic acids，free amino acids，and lactose incheese by capillary electrophoresis［J］.J.Dairy Sci.，2002，85，2122－2129.

［9］GB／T21676－2008，乳与乳制品脂肪酸的测定气相色谱法［S］.

［10］GB 4789.35－2010，食品微生物学检验乳酸菌检验［S］.

［11］Oh D K，Hong G H，Lee Y，etal.Production of conjugated linoleic acid by isolated Bifidobacterium strains［J］.World J.Microbiol.Biotechnol.，2003，19，907－912.

［12］Pariza M W，Hargraves W A.A beef derived mutagenesis modulator inhibits initiation of mouse epidermal tumor by 7，12－dimethylbenz［a］anthracene［J］.Carcinogenesis，1985，6，591－593.

［13］Rainio A，Vahvaselka M，Suomalainen T，etal.Production of conjugated linoleic acid by Propionibacterium freudenreichii ssp.Shermanii［J］.Lait，2002，82，91－101.

［14］Coakley M，Johnson M C，McGrath E，etal.Intestinal bifidobacteria that produce trans－9，trans－11conjugated linoleic acid：a fatty acid with antiproliferative activity against human colon SW480and HT cancer cells［J］.Nutr.Cancer 2006，56，95－102.

［15］Xu S，Boylston T D，Glatz B A.Conjugated linoleic acid content and organoleptic attributes of fermented milk products produced with probiotic bacteria［J］.J.Agric.Food Chem.，2005，53，9064－9072.

［16］Kepler C R，Tucker W P，Tove S B.Biohydrogenation of unsaturated fatty acids IV.Substrate specificity and inhibition of linoleic delta－12－cis，delta－11－trans－isomerase from Butyrivibrio fibrisolvens［J］.J.Biol.Chem.，1970，245，3612－3620.

［17］Regula A.Free fatty acid profiles of fermented beverages made from ewe＇s milk［J］.Lait，2007，87，71－77.

［18］Evers J M.The milk fat globule membrane compositional and structural changes post secretion by the mammary secretory cell［J］.Int.Dairy J.2004，14，661－674.

［19］Prieto B，Franco I，Prieto J G，etal.Proteolytic and lipolytic changes during the ripening of Leon raw cow＇s milk cheese，a Spanish traditional variety［J］.Int.J.Food Sci.Technol.，2002，37，661－671.

［20］Tamime A Y，Robinson R K.Yogurt，Science and Technology［M］.Wood head Publishing Ltd，Cambridge，England，2000.

［21］Rao D R，Reddy J C.Effect of lactic fermentation of milk on milk lipids［J］.J.Food Sci.，1984，49，748－750.

［22］Floernce A C R，Silva R C D.Increased CLA content in organic milk fermented by bifidobacteria or yoghurt cultures［J］.Dairy Sci.Technol.，2009，89，541－553.

［23］Oliveira R P S，Florence A C R，Silva R C，etal.Effect of different prebiotics on the production of nonfat symbiotic fermented milk，Int.J.Food Microbiol.，2009，128：467－472.

［24］Lin T Y，Lin C W，Wang Y J.Production of conjugated linoleic acid by enzyme extract of Lactobacillus acidophilus［J］.Food Chem.，2003，83，27－31.

［25］Guler Z，Gursoy－Balc1AC.Evaluation of volatile compounds and free fatty acids in set types yogurts made of ewes＇，goats＇milk and their mixture using two different commercial startercultures during refrigerated storage［J］.Food Chemistry，2011，27（1）：1065－1071.