UPLC-UV法测定不同产地青蒿中青蒿素的含量

向 文，李 琳，刘吉华*，余伯阳，2

青蒿素是由我国科学工作者，自主研发并在国际上注册的为数不多的一类新药之一。1971年屠呦呦等人在中国传统医药宝库中，发现并分离得到了具有抗疟疾活性成分 -青蒿素(Artemisinin，QHS)，开创了人类抗疟之路的一个新的里程碑，挽救了数百万人的生命，并于2011年9月23日获得国际医学大奖-美国拉斯克(临床研究奖)［1］。青蒿素是从菊科植物黄花蒿(Artemisia annua L.)中提取得到的一种新型倍半萜内酯的化合物，具有高效、快速、低毒的抗疟活性，尤其对具有抗氯喹能力的脑疟和急性疟有效［2］。

近年来对青蒿素类成分的研究表明，青蒿素除了独特的抗疟作用外，该类药还具抗寄生虫、抗真菌、抗卡氏肺孢子虫肺炎、抗心率失常、平喘及自身免疫调节等多种疗效［3］。同时，青蒿素及其衍生物以其独特的抗肿瘤机制和高效、低毒的抗肿瘤活性受到广泛关注［4］。

通过化学合成获得青蒿素已报道［5］，但由于其具有多个手性碳原子，使得合成步骤非常复杂，产率低、成本高，工业化生产很难实现。所以目前药用青蒿素主要从黄花蒿植株中提取获得［6］。因此，方便、快捷、准确检测青蒿中青蒿素的含量对青蒿的选种培育、青蒿素类药物生产及研究都具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试品青蒿药材分别采自重庆酉阳基地、安徽安庆和桐城、湖北恩施和赤壁吉林四平、山西太原、山东泰安和安丘、江苏南京等10个地区，经中国药科大学刘吉华教授鉴定。采集地上部分，阴干并粉碎后过60目筛，备用。

青蒿素对照品(批号:100202-200603)购自中国药品生物制品检定所;乙腈 (色谱纯，美国TEDIA)，纯水(自制)，石油醚，甲醇，乙醇，丙酮，氯仿，乙酸乙酯(分析纯，南京化学试剂厂)

1.2 实验仪器

UPLC-1290色谱仪(安捷伦公司)，Agilent 1260 DAD检测器，KQ-100型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)，低温离心机(BACKMAN公司)，RIOS-Elix纯水器(Millipore公司)

1.3 实验方法与结果

1.3.1 色谱条件

色谱柱:Agilent Eclipse Plus C18(2.1 mm ×50 mm，1.8μm);流动相:乙腈-水(45∶55);流速:1.0 mL/min;柱温:28℃;检测波长:200 nm;进样体积:1μL。

1.3.2 标准曲线的绘制

精密称取0.5 g青蒿素对照品，置于容量瓶中加甲醇定容到50 mL，摇匀，即为10 mg/mL的对照品溶液。

精密量取 0.1，0.2，0.4，0.6，1.0，2.0，4.0，6.0，10.0 mL置10 mL的容量瓶中，用甲醇稀释到刻度，摇匀，过0.22μm的滤膜，取续滤液1uL进样。以峰面积值A对进样量C进行线性回归，测定结果得标准曲线:A=109.41C+6.7 026，R2=0.9 993(n=9)。结果表明，进样量在0.10 117-10.117 μg范围内，青蒿素的峰面积与进样量有良好的线形关系(见图1)。

图1 青蒿素的标准曲线

图2 青蒿素的UPLC-UV色谱图

图3 基地(酉阳)药材的UPLC-UV色谱图

1.3.3 供试品的制备

精密称取10种不同产地的药材粉末0.3 g(每组3个平行)，置10 mL离心管中，加入5 mL的丙酮，称量并记录，超声提取30 min，取出后补足损失，离心(4 000 r/min，10 min)取上清2mL，挥干溶剂，用乙腈定容到1 mL，过0.22μm滤膜，取续滤液待用，即为供试品溶液。

1.3.4 不同产地药青蒿中青蒿素的含量测定

将上述1.3.3制备所得的“供试品溶液”，进UPLC分析，并根据峰面积计算出药材中的青蒿素的含量(见表1)。

表1 不同产地青蒿中青蒿素含量的比较

1.3.5 精密度

取同一供试品溶液，连续进样6次，每次1μL，测得峰面积值，计算RSD为1.7%。

1.3.6 稳定性

取同一供试品溶液，分别于0，2，4，8，12 和 24 h进样，测得其峰面积值，计算RSD为2.1%。

1.3.7 重复性

精密称取同产地药材粉末6份，每份为0.3 g，按“供试品溶液制备”项下操作，测定并计算青蒿素含量，6次测定值的RSD为2.3%，重现性良好。

1.3.8 加样回收率

采用加样回收法，取已知含量的同产地(基地)6份，每份0.15 g，精密称定，分别精密加入适量青蒿素，按“供试品溶液制备”项下操作，测定并计算青蒿素的回收率，结果回收率为99.3%，RSD为2.6%。

2 讨论

(1)本实验考察了6种常用溶剂提取效率的影响，选择了石油醚、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯为提取溶剂进行考察，结果表明丙酮提取效果较好，故选择丙酮为提取溶剂。

(2)青蒿素等倍半萜类化合物大多紫外吸收很弱，本实验采用末端吸收UPLC法测定青蒿中青蒿素的含量，同时选择在200 nm，205 nm，209 nm 3个波长处进行含量测定。结果显示，青蒿素在200 nm处的灵敏度较高且稳定。

由于甲醇在紫外的末端也有一定吸收，为避免流动相的干扰，所选用的流动相为乙腈/水系统。

(3)根据实验结果显示，不同产地的青蒿药材中青蒿素的含量差异很大，青蒿素的含量测定方法的改进有助于提高青蒿药材质量的监控。自青蒿素发现以来，关于青蒿素含量测定的方法很多［7］。95版药典第一次收录，采用紫外分光光度法检测青蒿素的含量［8］，ELSD-HPLC法亦常用于青蒿素的含量测定［9-10］，柱前衍生化-HPLC法是也较常用的方法［11-13］。但是该方法样品处理过程复杂，衍生试剂的浓度和加入量，反应温度和时间，流动相缓冲盐的种类和比例等因素都能对分析结果造成一定的影响。

与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及分离度都比HPLC要高［14］。本实验方法的特点在于样品的处理简单，适用于快速、准确地处理大批量的样品，分析过程中受干扰因素较少，减少多步操作从而降低分析过程中人为因素带来的误差。从经济角度来看，该方法大大缩短了分析周期、节约了人力物力、分析相同数量样品所有溶剂量也大大减少了。

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［12］ 张伟，秦民坚，王国凯.衍生化条件的优化及不同产地青蒿中青蒿素含量的柱前衍生化-HPLC法测定［J］.植物资源与环境学报，2011，20(1):88-90.

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