金樱子鞣质含量测定及其抗氧化提高生育力的实验研究

林芳花，彭永宏，沈翠霞，柴素芬

金樱子(Rosa laevigata Michx.)为蔷薇科植物，以成熟果实入药，味酸、甘、涩、平，具有固精缩尿，固崩止带，涩肠止泻的功能［1］，为药食同源植物，分布广，疗效显著，价廉易得，民间常用于补肾壮阳、治疗不孕不育症和日常保健强身。鞣质是多元酚类化合物，是植物次生代谢产物，具有收敛性，内服可治胃肠道出血、水泻等症，被认为是良好的天然抗氧化剂［2］。因此，本课题组拟对金樱子进行鞣质含量的测定、抗氧化活性和对果蝇生育能力影响的实验研究，为综合开发金樱子资源提供参考。

1 材料

1.1 药材及药品 金樱子于2010年11月采自河源南天中医药文化产业有限公司金樱子种植基地，经惠州学院生命科学系柴素芬副教授鉴定为蔷薇科植物金樱子(Rosa laevigata Michx.)。采摘后于烘箱中50℃干燥，粉碎，备用。果蝇于2010年10月购自中山大学，为美国野生型黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)。维生素C(Vc)购自天津市大茂化学试剂厂，分析纯，批号为2010－12－23。

1.2 试剂 玉米粉、蔗糖、酵母购于惠州市惠城区沃尔玛超市，干酪素为化学纯，琼脂粉为生化试剂，其余试剂均为分析纯。

1.3 器材 电子天平(上海精天电子仪器有限公司，精度0.1 mg)、超声波清洗仪(东莞市三源超声波设备有限公司)、紫外－可见分光光度计(日本岛津公司UV－2450)、微电脑光照培养箱(上海博讯实业有限公司SPX－300B－G)、电热恒温干燥箱(上海实验仪器厂 PH050)、中药粉碎机(温岭市大德中药机械有限公司DF－20)。

2 方法

2.1 金樱子不同部位鞣质含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取没食子酸50 mg，置100 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取5 mL，置50 mL棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.2 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，分别置25 mL棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1 mL，再分别加水 11.5 mL、11.0 mL、10.0 mL、9.0 mL、8.0 mL、7.0 mL，用10% 碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30 min，以相应的试剂为空白，照紫外－可见分光光度法(附录X A)，在760 nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2.1.3 供试品溶液的制备 分别取金樱子根、茎、叶、果实粉末各0.5 g，精密称定，分别置100 mL棕色量瓶中，加水60 mL，放置过夜，超声处理10 min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，静置，滤过，弃去初滤液30 mL，精密量取续滤液20 mL，置100 mL棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.4 供试品鞣质含量测定 按照《中国药典》2010年版一部(附录X B)鞣质含量测定法进行。

2.2 金樱子不同部位体外抗氧化活性

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取 Vc粉末0.05 g，置50 mL锥形瓶中，加入10 mL50% 乙醇，搅拌至溶解，置50 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取金樱子根、茎、叶、果实粉末各1 g，精密称定，置50 mL锥形瓶中，加入10 mL 50% 乙醇，静置30 min，超声提取30 min，过滤，滤液置100 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，备用。

2.2.3 氧化时间的测定 按照《中国药典》2010年版一部336页蜂胶项下方法进行。

2.2.4 超氧阴离子清除率的测定 按照文献［3］采用光照核黄素产生超氧阴离子自由基的方法测定。2.2.5还原力的测定 按照文献［4］采用普鲁士蓝法测定。

2.3 金樱子根对果蝇生育能力的影响

2.3.1 供试品溶液的制备 取金樱子根粉末5 g，精密称定，置100 mL锥形瓶中，加入50 mL水，放置过夜，次日超声提取30 min，过滤，备用。

2.3.2 果蝇培养基的配制 取700 mL水放入锅中，加入琼脂粉8 g，边加热边搅拌直至水沸腾，加入白糖40 g，再加入玉米糊65 g(先溶入200 mL冷水中调成糊状)，继续煮约8 min，停止加热，加入丙酸，搅拌，降温至50℃左右，加入酵母粉8 g，分装培养瓶，即得基本培养基。自加入酵母粉8 g起，分别加入供试品溶液，使培养基中含金樱子根生药浓度分别为2.0%、4.0%、8.0%，分装培养瓶，即得供试品培养基。

2.3.3 果蝇生育力的测定 收集同一批10 h内新羽化果蝇，乙醚麻醉后分雌雄，在基本培养基中饲养2周后，随机分成4组，每组10瓶，每瓶一对雌雄，其中3组置供试品培养基中饲养，1组置基本培养基中饲养作为对照组，7 d后去掉亲本，继续培养，每天定时观察，从第一只果蝇成虫出现开始计数，直至全部羽化，计录各组每瓶子一代(F1)和子二代(F2)果蝇数量。

2.3.4 统计学处理 实验数据以均数±标准差(±s)表示，多组间样本均数比较用方差分析进行统计学处理，全部数据经SPSS10.0统计软件进行统计分析。

3 结果与分析

3.1 金樱子不同部位鞣质含量测定结果 金樱子不同部位均含有鞣质，含量由高到低依次为叶、根、茎、果实，结果见表1。

表1 金樱子不同部位鞣质含量测定结果，n=3)

表1 金樱子不同部位鞣质含量测定结果，n=3)

样 品 鞣质含量(%)5.33茎2.00叶6.52果实根1.83

3.2 金樱子不同部位体外抗氧化活性结果 氧化时间越短，表明抗氧化能力越强，《中国药典》蜂胶项下规定的氧化时间(不得过22 s)。金樱子各部位氧化时间由短到长依次为根、叶、果实、茎，其中，根和叶的氧化时间短于Vc。在总还原力测定中，吸光度越大表明抗氧化能力越强，金樱子根和叶的吸光度与Vc相近，而茎和果实的吸光度低于Vc。超氧阴离子清除率越大表明抗氧化能力越强，金樱子根、茎、叶超氧阴离子清除率均高于Vc，果实超氧阴离子清除率虽然低于Vc但也达到34.60%。上述结果表明金樱子根、茎、叶和果实均有较强的体外抗氧化活性，结果见表2。

表2 金樱子不同部位体外抗氧化活性结果，n=3)

表2 金樱子不同部位体外抗氧化活性结果，n=3)

样 品 氧化时间(s) 超氧阴离子清除率(%) 吸光度(A)7.8 ± 0.9 49.71 0.667 ± 0.013茎 31.1 ± 0.1 55.46 0.357 ± 0.012叶 10.3 ± 0.9 52.53 0.668 ± 0.008果实 28.9 ± 1.1 52.05 0.540 ± 0.018根Vc 15.8 ± 0.6 45.03 0.690 ± 0.007

3.3 金樱子根对果蝇生育力的影响结果 金樱子根能增加果蝇交配后产生的F1和F2数量，且与剂量存在正相关性，具有提高果蝇的生育力的作用。与对照组相比，4.0%和8.0%浓度组能显著增加果蝇F1数量，增殖率分别为 44.62%和 65.64%;4.0%浓度组对果蝇F2增殖率达到138.67%，非常显著地增加果蝇F2数量，2.0%组和8.0%组亦显著提高果蝇 F2数量，增殖率分别为68.23%和71.82%，结果见表3和表4。

4 小结

生物氧化是指在生物体内代谢物脱下的氢及电子，通过一系列酶促反应与氧结合生成水，并释放能量维持机体正常生理功能的过程。

表3 金樱子根对果蝇F1数量的影响，n=10)

表3 金樱子根对果蝇F1数量的影响，n=10)

金樱子根浓度(%)产果蝇总数(只)平均每对产果蝇数 (只) F1增殖率 (%)0.0 195 21.7 ± 2.1 －2.0 235 26.1 ± 2.2 20.51 4.0 282 40.2 ± 2.4* 44.62 8.0 323 40.4 ± 2.5*65.64

表4 金樱子根对果蝇F2数量的影响，n=10)

表4 金樱子根对果蝇F2数量的影响，n=10)

注:增殖率=(实验组羽化果蝇数－对照组羽化果蝇数)/对照组羽化果蝇数×100%与对照组比较，*:p＜0.05，＊＊:p＜0.01

金樱子根浓度(%)产果蝇总数(只)平均每对产果蝇数(只) 增殖率(%)71.82 0.0 362 40.2 ±2.9 －2.0 609 60.9 ±3.1* 68.23 4.0 864 86.4 ±4.1＊＊ 138.67 8.0 622 62.2 ±3.0*

生物氧化过程伴随产生自由基，过量的自由基对机体是有害的，可攻击细胞内DNA、蛋白质、脂质、糖类、有机酸等生物分子，人类许多重大疾病如动脉粥样硬化、风湿性关节炎、糖尿病、癌症、生殖发育、衰老均与自由基造成的氧化损伤有关。天然植物包括蔬菜、水果、谷物及中草药等都含有黄酮、多酚、鞣质、皂苷及生物碱等抗氧化活性成分，从资源丰富的天然植物中研究与开发抗氧化活性物质成为国内外学者研究的热点［2］。

历代医书记载金樱子常以果实和根入药，具有固精摄精、缩尿、止泻、止带的作用。鞣质是植物多酚类化合物，是植物次生代谢物，是人及动物重要的抗氧化功能因子。本实验研究结果表明金樱子根、茎、叶、果实均含有鞣质，尤以根和叶的含量丰富，均有不同程度抗氧化活性;金樱子根能显著提高果蝇的生育力，提示我们金樱子根、茎、叶、果实均可以作为抗氧化功能活性因子研究与开发的材料。由于时间有限，本文仅就金樱子根、茎、叶、果实鞣质含量和体外抗氧化活性，金樱子根对果蝇的繁殖力的影响进行初步研究，希望能够为寻找金樱子抗氧化、延缓衰老、提高生育力等保健功能因子的研究与开发提供参考。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)［S］.北京:化学工业出版社，2010.

［2］ 郑荣梁，黄中洋.自由基生物学［M］.北京:高等教育出版社，2007.

［3］ 施跃坚，陈海云.绞股蓝体外抗活性氧自由基的研究［J］.云南民族大学学报:自然科学版，2008，(3):241－243.

［4］ 徐亚民，马越，赵晓燕.紫苏等4种天然色素抗氧化能力的比较［J］.华北农学报，2007，22(2):187 －190.