骨膜瓣复合异体骨移植修复大段骨缺损

张大伟 田清业 刘光军 刘雪涛 王谦 杨磊

高能量损伤、肿瘤切除及先天畸形都可引起四肢长骨的大段缺损。大段骨缺损常用自体骨和异体骨移植治疗。无论是自体骨移植还是异体骨移植，大段移植骨中部爬行替代缓慢，极易出现骨溶解吸收、骨折等并发症。较理想的方法是自体骨瓣移植，但自体骨瓣因骨量有限，临床应用受到限制。近年来有报道使用带血管骨膜瓣复合异体骨移植的手术方法，该类方法中较经典的是带血管腓骨瓣复合大段异体骨移植，具有操作简单、副损伤小、骨膜瓣来源广泛等优点[1]，但王剑利等[2]报道的6例临床应用中，2例出现一端不愈合、1例并发感染、1例并发骨折，并认为导致该问题的原因为骨膜瓣复合的位置及异体骨血管化受限。因此，我们将带薄层皮质骨的骨膜瓣嵌入开窗的异体骨，为临床长段骨缺损的治疗提供参考和资料。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康正常成年家兔60只，体质量2.5～3.5 Kg，雌雄不限，由解放军89医院实验中心提供。随机分为3组（n=20），即实验组、对照组及空白对照组。

1.2 主要实验仪器与试剂

计算机控制温度速率仪（美国MVE公司）、深低温冰箱（美国Dupont Suva公司）、口腔电动磨钻（荷兰Philips公司）、计算机X线成像(CR)（美国GE公司）、2500E型切片机（德国LEICA公司）、VEGF免疫组化试剂盒（美国RD生物工程公司）、EDTA（台州市晶皓化工有限公司）、TBS（台州市晶皓化工有限公司）。

1.3 大段同种异体骨的制作

健康正常成体家兔10只，无菌条件下截取双侧胫骨干3.0 cm，去除软组织，刮除骨髓，盐水反复冲洗干净，浸泡于庆大霉素盐水中，用双层血浆袋保存。计算机控制温度速率仪按2℃/min的降温速率将骨组织的环境温度降至-80℃，再置入深低温冰箱中保存。共制备异体骨段标本20个备用。

1.4 手术方法

动物禁食水12 h，左后肢脱毛，3%戊巴比妥钠按30 mg/Kg的剂量静脉滴入，麻醉生效后，常规消毒铺无菌单，于小腿中段作一约3 cm的纵行切口，依次切开皮肤、皮下组织，分离并保护胫前血管及其分支，切除1 cm长胫骨，制成胫骨骨缺损模型。将已制备的长管状同种异体骨按两步解冻法解冻，截成1 cm长骨段备用。

1.4.1 实验组

切取1/2周径骨膜及其附带的薄层骨皮质，保留骨膜表面的薄层肌袖。以口腔磨钻于大段异体骨中部开一骨窗，面积约5 mm×5 mm、深约1 mm（图1、2），大小与骨膜瓣相近，深达骨松质，将异体骨嵌入骨缺损处，直径2.0 mm的克氏针髓内固定，然后将骨膜瓣嵌入骨窗，丝线捆绑。

1.4.2 对照组

切取1/2周径骨膜及其表面的肌袖，异体骨直接嵌入骨缺损处，直径2.0 mm的克氏针髓内固定，骨膜瓣包裹覆盖，丝线捆绑。

1.4.3 空白对照组

将骨膜及表面的肌袖彻底剥离后去除，异体骨直接嵌入骨缺损处，直径2.0 mm的克氏针髓内固定。关闭切口，无菌敷料包扎固定。

自手术日起,所有动物每日2万单位的庆大霉素肌肉注射，连续一周。隔天换药。

1.5 观察指标

实验动物术后依次于4、8、12、16周处死并观察以下指标。

1.5.1 大体观察

解剖出异体骨标本，肉眼观察新生骨痂数量，骨膜瓣及骨组织血运及骨膜瓣与异体骨贴附结合情况。

1.5.2 X线摄片及骨痂半定量分析

术后立即、术后的4，8，12，16周分别截取动物左后肢行X线的检测，每次每组随机抽取2只，仔细观察不同时期内的骨缺损愈合情况，骨痂的形成情况。并将CR图像存入计算机，应用Image Pro Plus 6.0图像分析软件对各组骨痂区相同面积进行分析，计算出骨痂灰度密度积分。

1.5.3 光镜下组织学观察和免疫组织化学观察

分别取术后4、8、12、16周的骨组织及附带的骨膜等周围软组织，制备10 μm石蜡切片，苏木精伊红(HE)染色观察。

每组任取10张切片，常规脱蜡至水，经抗原修复后，应用SABC法对作用于血管内皮细胞的特异性因子VEGF进行原位标记。光镜下观察新生小血管的分布，随机选取4个视野，观察并计数VEGF表达阳性细胞。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 三组移植骨段大体观察

①实验组：4周时已形成纤维包裹，移植骨与宿主骨之间有大量纤维连结，骨膜瓣与移植骨结合紧密，以骨刀将其剥离后可见较多横行血管肉芽组织进入移植骨；8周时，两结合处连接紧密，骨膜瓣与移植骨融为一体；12周时移植骨周围纤维囊硬化，有大量骨痂形成；16周时已形成新的皮质骨结构，髓腔融合。②对照组：4周时异体骨块形成纤维包裹，骨膜瓣与移植骨贴附松散，偶见小的液化腔；8周时骨膜瓣可从移植骨表面剥离，有少量横行血管肉芽进入移植骨，移植骨皮质凹凸不平；12周时移植骨周围纤维囊硬化，有大量骨痂形成；16周时形成新的皮质骨结构，髓腔部分融合。③空白对照组：周时移植骨无显著变化，移植骨与宿主骨之间有少量纤维连结；8周时形成纤维包裹，移植骨与宿主骨之间形成纤维连结；12周时两结合处仍以纤维连结为主；16周时纤维包裹硬化，有少量骨痂。

2.2 X线摄片及骨痂半定量分析

①实验组：4周时骨断端变得稍模糊，可见少量骨痂包绕异体骨，移植骨的形状和密度无明显的改变；8周、12周时接触面变得模糊，移植物轮廓亦变得模糊，密度稍变低，骨痂包裹移植物，嵌入组皮质骨开窗处有大量骨痂形成；16周时移植骨两端已与宿主连接，骨密度接近宿主自身骨，开窗处皮质骨连续性大部恢复（图3）。②对照组：4周时少量骨痂包绕异体骨，移植骨的形状和密度无明显的改变；8周、12周时骨端接触面变得模糊，移植物轮廓亦变得模糊，密度稍变低；16周时异体骨周围有大量骨痂包绕（图4）。③空白对照组：4周时远、近端结合部骨折线清晰，未见外骨痂生长；8周、12周时移植异体骨段骨密度仍较高，远、近端结合部骨折线变得稍模糊，仅见少量外层骨痂生长；16周时移植骨周围有骨痂形成，但其密度和数量均低于实验组，骨端骨折线变得模糊，部分内固定克氏针断裂（图5）。经图像分析系统计算骨痂灰度密度积分，实验组新生骨痂数量和质量优于对照组及空白对照组（表1），差别有统计学意义。

表1 不同时间点骨痂灰度积分Table 1 The average value of callus grey level in different time points

2.3 组织学观察

2.3.1 HE染色

①实验组：4周时异体骨哈弗管内均为无结构状，异体骨与宿主骨结合处可见有少量纤维肉芽组织连接，开窗处可见大量纤维肉芽组织侵入松质骨骨小梁；8周时异体骨内哈弗管扩大，有大量新生血管自开窗处长入并向两断端爬行、伴新骨生成，并有少量新生骨小梁突向髓腔内，新生血管数量及新生骨量较多；12周时新生骨单位和残存骨单位并存，新生骨单位哈佛氏管内可见血管和活的细胞成分，周边骨旋涡排列有规律，其内可见大量成骨及破骨细胞；16周时开窗处已形成新的密质结构，有大量成熟的骨小梁，髓腔基本融合，异体骨内部见多数成熟骨单位，偶见残存骨单位，骨单位哈佛氏管内可见血管和活的细胞（图6）。②对照组：4周时异体骨哈弗管内均为无结构状，异体骨与宿主骨结合处可见有少量纤维肉芽组织连接，异体骨边缘皮质有少量不规则的吸收陷窝；8周时表面吸收腔扩大，与宿主哈弗管相通，有少量新生血管长入并伴新骨生成；12周时靠近外表面和髓腔侧切片内亦可见新生骨单位，中间部位切片仍见大量坏死残存的骨单位；16周时仅在自体骨-异体骨连接处见较多成熟骨小梁，连接处髓腔基本融合，异体骨段外周新形成一薄层骨密质，异体骨密质表面仍可见大量破骨细胞吸收陷窝及成骨细胞，异体骨内部可见新生骨单位与残存骨单位并存（图7）。③空白对照组：4周时异体骨哈弗管内均为无结构状；8周时异体骨边缘皮质有少量不规则的吸收陷窝；12周时哈佛氏管扩大，其内未见细胞成分，周边骨旋涡排列紊乱，中央空虚，无细胞结构；16周时哈佛氏管扩大，其内见新生血管自自体骨-异体骨连接处向内部爬行，新生骨单位量较少（图8）。

2.3.2 免疫组化染色

VEGF阳性效应产物呈棕黄色颗粒状分布于成骨细胞、成软骨细胞及纤维细胞的细胞包浆。我们按照以下标准记录评分结果和阳性细胞数：①阴性（-）：细胞内无着色，评分：0 分；②弱阳性（+）：细胞染成淡黄色，阳性细胞<25%，评分：1分；③阳性（++）：细胞染成黄色，阳性细胞数25%～50%，评分：2分；④强阳性（+++）：细胞染成棕黄色。阳性细胞数>50%，评分：3分。结果显示：①正常情况下（即空白对照组）在移植早期VEGF的表达仅出现在外周软组织内，移植中期在移植骨外表面及内部均有少量表达，移植晚期在外周骨痂及皮质骨表达较少、松质骨部分表达较多；②实验组移植骨在整个爬行替代过程中VEGF表达水平均较高；早期即在移植骨表面及内部有较高水平的表达，中期及晚期皮质骨内持续高水平表达；晚期外周骨痂形成后，皮质骨及松质骨内表达水平仍较高。③对照组移植骨VEGF表达水平较嵌入组为低，皮质骨内表达低下，待外周骨痂形成后更进一步降低（表2-4）。

表2 实验组不同时间点、不同区域VEGF的表达Table 2 The VEGF expression of experimental group in different time points and different regions

表3 包裹组不同时间点、不同区域VEGF的表达Table 3 The VEGF expression of control group in different time points and different regions

表4 空白对照组不同时间点、不同区域VEGF的表达Table 4 The VEGF expression of blank group in different time points and different regions

图1 异体骨开窗面积Fig.1 Bone window area of allograft bone

图2 异体骨开窗深度Fig.2 Bone window depth of allograft bone

图3 实验组术后4周X线片Fig.3 The X-ray film of the rabbit tibia 4 weeks after operation in experimental group

图4 对照组术后4周X线片Fig.4 The X-ray film of the rabbit tibia 4 weeks after operation in control group

图5 空白对照组术后4周X线片Fig.5 The X-ray film of the rabbit tibia 4 weeks after operation in blank group

图6 实验组组织学观察见新生骨皮质（HE，400×）Fig.6 New bone cortex formation was observed in experimental group by HE staining(HE,400×)

图7 对照组组织学观察见残存骨单位（HE，400×）Fig.7 Remaining bone unit was observed in control group by HE staining(HE,400×)

图8 空白对照组组织学观察见髓腔内坏死（HE，400×）Fig.8 Marrow necrosis was observed in blank group by HE staining (HE,400×)

3 讨论

带血管骨膜瓣复合异体骨移植是近年来显微外科技术在异体骨移植领域的新进展，诸多动物实验【3】证明了带血管骨膜瓣具有改善受区骨床血供、促进大段异体骨血管化、加速异体骨爬行替代速度的优点，但该方法在临床实际应用中的效果却欠佳，尤其是与经典的带血管腓骨瓣复合移植相比。我们认为导致该问题的原因包括：①直接以骨膜瓣包裹异体骨段，骨膜瓣容易因为手术操作中周围软组织嵌入、骨缺损断端截骨产生的血肿、移植早期急性排斥反应导致的炎性渗出等原因致使骨膜瓣自异体骨表面浮起、贴附不紧密，必然会影响骨膜瓣作用的发挥。②带血管骨膜瓣不仅可以提供丰富的血供，更重要的是它具有很强的成骨作用。组织学研究【4】表明骨膜分浅表的纤维层、中间的血管性未分化层和深面的生发层。纤维层中有Sharpy纤维穿入骨质，起固定骨膜和韧带的作用。生发层紧贴骨表面，血管和细胞丰富，有成骨能力，又称成骨层。由于Sharpy纤维将骨膜与骨紧紧相连，从骨上掀起骨膜时，骨膜的生发层会受到损伤，不可避免地会响骨膜的成骨能力。因此单纯以骨膜覆盖而不附带薄层皮质骨，有影响骨膜瓣成骨活性的可能。③皮质骨结构紧密，其爬行替代过程表现为第一阶段暴露缘被破骨细胞吸收，形成“陷窝”或“网眼”，哈弗管转变为小的髓腔，肉芽组织长入，原始间充质细胞充填大的腔隙；第二阶段髓腔达到预想的大小，吸收停止，成骨细胞充填腔隙同时伴有活性的骨样组织沉积。因此，直接与皮质骨相接触的骨膜瓣虽然可以提供充足确实的局部血供、大量的活性骨细胞、细胞因子等有利于异体骨愈合的因素，但如果无法募集及分化出大量破骨细胞、单核及多核巨噬细胞[5]，必然会导致爬行替代的不完全。④实验中可见，在中晚期随着对照组骨膜瓣下新骨的沉积、异体骨表面骨痂的形成，异体骨内部的血管化速度、新骨生成量进一步下降，即由于新骨的生成，阻碍了骨膜内血管向异体骨深部长入、限制了内部破骨细胞的量，导致表层皮质骨被替代，而深层皮质骨、松质骨的替代受到限制。这是直接包裹法的又一缺点。

针对上述问题，我们在实验中进行了相应改进。①经开窗嵌入，骨膜瓣与大段异体骨中部结合紧密，确实可靠的结合是骨膜瓣发挥作用的前提条件。在实验中可见，骨膜瓣附带的薄层皮质骨早期即可与异体骨段形成纤维连结，随着骨质沉积，彻底与异体骨融为一体。带血管骨膜瓣所提供的丰富的血供及其生发层募集、分化的各种活性骨细胞可通过此薄层皮质骨进入异体骨段深部，事实上成为了骨缺损两断端之外的第三个爬行替代的“活化中心”，其作用类似于带血管腓骨瓣复合异体骨移植中的自体骨，且在爬行替代结束后成为“异体骨”皮质的一部分。②切取骨膜瓣时，用锐利骨凿凿取薄层皮质骨并同时掀起骨膜。一方面，能完整获得范围较大的骨膜；另一方面，既不损伤骨膜又保留了皮质骨的活力，两者在受区共同作用，充分发挥骨膜瓣的成骨潜能，加速异体骨的爬行替代。③将骨膜瓣由直接包裹改为嵌入，改变了大段异体骨中部爬行替代的次序。深部的松质骨首先活化，有新生血管及肉芽组织长入，继而在松质骨及髓腔内形成大量骨痂，而皮质骨则由外骨痂经改造塑形后重新形成。松质骨是具有高度疏松多孔的、开放的小梁状结构，而皮质骨中的孔隙主要为致密板层骨的哈佛管及福克曼管系统，其孔隙率、孔径及孔隙间的交通率均明显低于松质骨，在移植早期出现的局部创伤、血肿形成及纤维机化过程中两者并无差异，而其后的毛细血管长入则大为不同，松质骨移植后后数小时内血管化已开始，至大约2周时已达到完全血管化，而皮质骨的完全血管化需大约2个月时间，此时的松质骨已完全被新生骨和骨样组织所填满[6，7]。因此这一改变从整体上加速了爬行替代的速度，此外还避免了后期表面骨痂的形成对深部异体骨替代的阻碍。因此在实验中嵌入法与包裹法相比在血管化速度、新骨生成及完全愈合后生物力学强度三方面均表现出了一定的优势。

针对今后的临床应用，我们认为本方法在使用中应注意：①切取皮质骨-骨膜瓣时应仔细游离并保护其营养血管，注意两者的解剖联系，勿使骨膜与皮质骨分离。②皮质骨-骨膜瓣切取的位置以股骨内侧髁区域为首选，即形成以膝降动脉为蒂的骨膜瓣[8]。此处位置表浅、血管变异较少、皮质骨菲薄、可取面积较大（平均6 cm×3 cm），并且可附带相应皮瓣修复皮肤缺损[9]。③由于大段异体骨中部皮质骨开窗，必然会导致开窗侧的应力集中，有导致异体骨医源性骨折的可能性。因此采用髓内固定、避免偏心固定，并于移植早期辅助以适当外固定是必要的。随着移植后期大段移植骨改造塑形结束，“异体骨”强度得以恢复，该问题自然会得以解决。

以带血管薄层皮质骨-骨膜瓣嵌入开窗的异体骨修复大段骨缺损的手术方法优于以骨膜瓣直接包裹异体骨的方法，缩短骨缺损修复的时间，提高修复的程度，在临床大段骨缺损的治疗中有广阔的应用前景。

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