骨髓间充质干细胞的免疫学特性及其同种异体的应用研究进展
2012-01-22武京国综述曹谊林肖苒审校
武京国 综述 曹谊林 肖苒 审校
BMSCs是一类存在于骨髓基质中的成体干细胞,参与骨髓微环境的形成,具有向中胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化的潜能。由于BMSCs没有特异性表面抗原标志分子,因此通常以细胞表面抗原CD29、CD44、CD90、CD105等阳性标志,以及CD34、CD45等阴性标志作为鉴别指标。目前,分离BMSCs的方法有贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法和磁珠分离法等。自体BMSCs的数量和功能受年龄、疾病等因素的影响[1],体外扩增时间长。因此,Allo-BMSCs更符合临床应用的要求。本文就BMSCs的免疫学特性及其同种异体的应用研究进展进行综述。
1 BMSCs的免疫学特性
1.1 BMSCs的低免疫原性
多数研究认为,BMSCs高表达MHCⅠ类分子,不表达MHCⅡ类分子,低表达共刺激分子B7-1(CD80),不表达B7-2(CD86)。MHCⅠ类分子与NK细胞表达的杀伤抑制受体(KLR)结合,使NK细胞对异体或肿瘤细胞的杀伤作用下调,从而保护BMSCs免受NK细胞的杀伤。此外,BMSCs不表达Fas配基和多种共刺激分子,可能会引起T淋巴细胞无能,诱导免疫耐受。然而Le Blance等[2]通过Western blotting的方法,在BMSCs全细胞裂解物中检测到了MHCⅡ类抗原的存在,用IFN-γ刺激BMSCs也会使 90%以上的细胞表达MHCⅡ类抗原,而有无 IFN-γ刺激,BMSCs均不会引起T细胞增殖。Potian等[3]也发现BMSCs既表达MHCⅠ类抗原也表达MHCⅡ类抗原,但没有明显的免疫原性,且对免疫反应有抑制作用。这些研究提示,MHC的表达可能不是导致BMSCs免疫豁免的主要因素。Tse等[4]发现,共刺激分子B7-1或B7-2基因转染的BMSCs仍不能引起T细胞的增殖活化,也不支持BMSCs是由于缺乏共刺激分子而导致T淋巴细胞增殖受抑制。
Chan等[5]却发现BMSCs在一定条件下可能作为抗原提呈细胞(APC),引发受体的免疫排斥反应。Nauta等[6]认为BMSC能够诱导机体记忆性T细胞激活,并针对移植物发生免疫排斥,减少移植物的存活时间。总之,BMSCs可能不是完全免疫豁免的,因此需要进一步研究BMSCs可能诱发免疫反应的相关因素,了解同种异体BMSCs与免疫系统的相互作用,确保将来临床应用的安全性。
1.2 BMSCs与同种异体免疫系统的相互作用
机体的免疫应答包括固有免疫(Innate immunity)和适应性免疫(Adaptive immunity)。固有免疫对外来侵入的病原体迅速应答,同时在适应性免疫的启动、调节和效应阶段也起重要作用。适应性免疫分为细胞免疫和体液免疫。T细胞是细胞免疫的主要效应细胞,包括细胞毒性T细胞(Cytotoxic T cells,Tc)、辅助性 T 细胞(Helper T cells,Th)和抑制性 T 细胞(Suppressor T cells,Ts)。负责体液免疫的是B细胞,产生与相应抗原发生特异性结合反应的抗体。
1.2.1 BMSCs与固有免疫
BMSCs表达 CD55、CD46和 CD59,分泌 Facor H,从而通过补体系统避免机体发生超急性和急性免疫排斥反应。然而,BMSCs并非与固有免疫没有任何联系,Schraufstatter等[7]发现补体C3a和C5a能够趋化BMSCs到达组织损伤部位。体外研究也发现,BMSCs通过释放前列腺素E2(PE2)和吲哚胺双加氧酶(IDO)抑制NK细胞的增殖活化。BMSCs还能够抑制静息或活化状态下中性粒细胞的凋亡,从而维持其吞噬和趋化功能。这些研究表明,BMSCs能够以某种特定的方式调节固有免疫,从而避免炎症和免疫反应的发生。
1.2.2 BMSCs与细胞免疫
树突状细胞(DC)作为CD4+Th细胞的抗原提呈细胞在适应性免疫中发挥着关键作用,BMSCs能够从多方面调节DC的生物学活性。BMSCs和DC前体细胞共同存在于骨髓基质中,抑制单核细胞向DC前体细胞分化。BMSCs抑制DC向CD4+Th细胞提呈抗原,抑制DC表达钙黏素,降低其趋化作用。通过BMSCs的调节,DC分泌IL-12减少,而IL-10的分泌增加,从而通过诱导调节性T淋巴细胞(Treg)间接介导免疫耐受[8]。
BMSCs可调节T淋巴细胞分化。Batten等[9]研究发现,BMSCs分泌多种细胞因子,使Th1细胞数量减少,Th2细胞数量增加,还能通过抑制细胞因子IL-17、IL-22、IFN-γ和TNF-α的表达,阻止CD4+T淋巴细胞向Th1细胞方向分化,而且在炎症环境中,通过CCR6介导Th1细胞的黏附,诱导Treg发挥抗炎作用。因此,BMSCs具有直接抑制效应性CD4+T淋巴细胞和激活并维持Treg的潜能。
1.2.3 BMSCs与体液免疫
目前关于BMSCs与B细胞以及抗体产生的关系还存在争议。Rafei等[10]发现,BMSCs能抑制B细胞增殖和免疫球蛋白的产生,这些作用是通过CCL12、INF-γ以及PD1/PDL1实现的。Rasmusson等[11]却发现BMSCs分泌的细胞因子能活化B细胞或浆细胞。因此,BMSCs和B细胞、浆细胞之间可能存在着复杂的联系,究竟BMSCs是抑制抗体的产生利于临床应用还是激活B细胞分泌抗体而限制其应用,还需进一步研究。
1.3 BMSCs在同种异体内的免疫豁免程度
关于BMSCs在同种异体内的免疫原性目前还存在争议。Chen等[12]认为,BMSCs在自体和同种异体内均无免疫反应;而Isakova等[13]在对MHC错配的恒河猴进行颅内BMSCs注射时却发现,外周血淋巴细胞亚群发生了改变,MSCs的免疫原性呈剂量依赖性。Rafei等[14]用allo-BMSCs对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠进行静脉注射,虽然发生了T淋巴细胞反应,但BMSCs仍有治疗作用,提示BMSCs的免疫原性和它所发挥的生物学作用可以共存。此外,BMSCs植入部位也是影响其免疫原性的重要因素,植入颅骨、大脑、关节腔等部位细胞表现出低免疫原性,而静脉、腹腔、皮下和心肌注射易引发机体免疫反应。
BMSCs在同种异体内是否完全免疫豁免,或者能够在多大程度上逃避免疫排斥反应,以及需在体内存活多长时间才能发挥它的最大作用,能否达到自体BMSCs所发挥的作用,目前还不是很明确。体内短时间存在的BMSCs可能会发挥一定的生物学作用,但BMSCs的长期存活以及移植数量多少是否会因免疫反应而发生生物学作用的改变,BMSCs的免疫原性和它所发挥的生物学作用是否可以共存,还有待于深入研究。
2 Allo-BMSCs在动物实验研究中的应用
大量研究表明,BMSCs在同种异体内具有低免疫原性和免疫调节作用,从而使干细胞移植避免了同种异体MHC配型的局限性,而且BMSCs移植后具有定向分化和旁分泌功能。目前,Allo-BMSCs在动物实验研究中的应用包括促进组织再生、组织工程化组织构建、受体免疫调节等方面。
2.1 Allo-BMSCs在再生医学和组织工程中的应用
2.1.1 细胞治疗应用研究
Makkar等[15]通过结扎冠状动脉的方法建立动物心肌梗死模型,应用Allo-BMSCs移植,结果显示在没有使用免疫抑制剂的情况下受体未发生免疫排斥,而且BMSCs在梗死部位存活并分化为终末的心肌细胞,使心功能得到了明显的改善。Imanishi等[16]发现心肌注射Allo-BMSCs对急性心肌梗塞(AMI)大鼠有效,BMSCs促进了血管内皮生长因子(VEGF)的分泌,同时无免疫反应发生。有研究认为,BMSCs移植后通过血脑屏障,能够分泌神经营养因子(NTFs)发挥营养支持作用,由于外源性神经营养因子(NTFs)不能通过血脑屏障,因此将BMSCs注射到动物脑缺血部位,能够促进局部组织血管化和神经功能的恢复[17]。Togel等[18]应用BMSCs治疗急性肾缺血再灌注损伤时发现,自体细胞移植效果优于异体细胞移植。因此,Allo-BMSCs在细胞治疗中的作用还需更多研究。
2.1.2 Allo-BMSCs在组织工程中的应用
BMSCs作为种子细胞已广泛应用于组织工程化组织和器官的构建,而Allo-BMSCs复合生物材料移植入体内后的免疫原性如何,复合物能否成功构建组织和修复缺损,大量动物实验在骨和软骨领域中开展。Djouad等[19]将携带BMP基因的BMSCs注射到同种异体小鼠的关节腔和肌肉间隙中,发现虽然有淋巴细胞浸润,但细胞能够在异位成骨。Roberta等[20]用Allo-BMSCs复合羟基磷灰石(HA)植入小鼠皮下,却引起了机体的免疫排斥反应,没有形成新生骨组织。Akahane等[21]在使用免疫抑制剂FK506的情况下,将Allo-BMSCs和HA复合物植入大鼠皮下形成了新生骨组织;Tsuchida等[22]也在使用FK506的情况下,利用同种异体组织工程骨修复了大鼠股骨缺损。但是,免疫抑制剂可能导致严重的毒副作用。Arinzeh等[23]在应用同种异体组织工程骨修复犬股骨缺损的实验研究中,没有任何免疫防治措施干预,却能够完成骨缺损的修复,也没有发生免疫排斥反应,组织学观察无淋巴细胞浸润,受体血清中也没有检测到同种抗体。Guo等[24]发现自体或异体BMSCs构建的组织工程骨在修复猪的胫骨缺损中,虽然早期存在一定的炎症或免疫反应,但不影响新骨的形成和缺损的修复。
在同种异体组织工程软骨构建和缺损修复方面,Pei等[25]应用兔关节滑膜来源的BMSCs,复合PGA支架,成功修复了同种异体的膝关节全层软骨缺损,没有发生免疫排斥。而Acosta等[26]通过Allo-BMSCs-材料复合物移植修复猪的椎间盘时在缺损部位,却没有发现存活的BMSCs,缺损最终瘢痕愈合。动物种属不同,细胞-材料复合物植入部位不同,Allo-BMSCs作为组织工程的种子细胞发生免疫反应的程度和修复效果存在很大差异,真正进入临床应用还有待深入研究和更多大动物实验。
2.2 Allo-BMSCs调节机体免疫
2.2.1 BMSCs在同种异体组织移植中的免疫抑制作用
2002年,Bartholomew等[27]在进行动物同种异体皮肤移植时,同时对受体输入Allo-BMSCs,延长了移植皮肤的存活时间,提示BMSCs可能具有抑制组织移植免疫排斥的作用。Allo-BMSCs能降低同种异基因造血干细胞移植(HSCT)过程中移植物抗宿主病(GvHD)的发生率。Polchert等[28]发现IFN-γ活化的BMSCs能显著抑制T淋巴细胞增殖,从而降低GvHD的发生率。HSCT联合BMSCs移植还能促进造血干细胞(HSCs)归巢和增殖,提高移植效率,缩短因大剂量化疗导致骨髓抑制的时间,尽快恢复自主造血。
2.2.2 Allo-BMSCs在自身免疫性疾病中的免疫调节作用
Ⅰ型糖尿病时胰岛细胞移植是治疗手段之一,同时联合Allo-BMSCs移植可诱导免疫耐受,延长移植胰岛细胞存活时间和保护其分泌胰岛素功能[29]。Schena等[30]发现,Allo-BMSCs能够通过抑制IFN-γ依赖性B淋巴细胞增殖,保护因系统性红斑狼疮(SLE)造成的肾脏损害。自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是由T细胞介导的中枢神经系统炎症,Rafei等[14]同样发现Allo-BMSCs对EAE有效。目前认为,再生障碍性贫血(AA)同样由免疫因素介导,Allo-BMSCs可能通过影响T细胞亚群分化改善AA症状。
3 Allo-BMSCs的临床应用及存在的问题
3.1 Allo-BMSCs临床应用个案报道
由于目前没有制定Allo-BMSCs的应用标准,细胞在体内的免疫反应、转归以及安全性问题还需研究,因此临床应用仅限于个案报道。Tateishi-Yuyama等[31]对下肢动脉缺血性疾病患者局部注射Allo-BMSCs,踝臂指数(ABI)得到了显著性提高。严重的儿童成骨不全患者移植Allo-BMSCs后,发现能表达正常胶原。Fouillard等[32]将Allo-BMSCs输入接受自体骨髓移植(ABMT)治疗的白血病患者体内,发现BMSCs能改善机体造血功能,无GvHD的发生。部分大剂量化疗后、SLE和AA进行HSCT或胰岛移植过程中,同时输入Allo-BMSCs,具有协同作用,患者临床症状得到了改善[33,34]。糖尿病患者采用胰岛细胞联合Allo-BMSCs移植治疗也取得了不错的效果。郭可泉等[35]通过HLA不相合的骨髓干细胞移植诱导心脏移植后,受者特异性免疫耐受,有效建立嵌合体,但远期效果有待继续观察。组织工程骨和软骨进入临床大都采用自体BMSCs[36],未见Allo-BMSCs的相关报道。
3.2 Allo-BMSCs临床应用存在的诸多问题
Allo-BMSCs的研究广泛处于临床前期,还有许多问题有待解决:①细胞的来源、纯化、体外增殖分化、储存运输以及安全性检测等,目前国际上还没有明确统一的标准,尤其是对细胞进行基因修饰,可能存在疾病传播的风险;②生产过程中可能存在的外来污染、培养液带来的生物源性因素等问题,目前也没有指导性建议;③部分患者可能对产品存在过敏、同种抗体免疫排斥等不良反应,如何应对副作用的发生;④细胞植入体内的长期转归,最终能否与机体整合,并进行正常的营养代谢等生理活动,有无致瘤性、疾病传染等安全问题,还需要大量动物实验和临床前期的长期观察,以期能提供理论和应用依据[37]。
4 前景和展望
同种异体BMSCs作用的免疫环境是动态的、复杂的,因此能否在临床中产生良好的预期效果,还需要进一步的动物实验和临床前期实验证实。另外,最近有研究发现,BMSCs长期培养后具有恶变潜质,也可能会因对机体的免疫抑制作用而促进肿瘤的形成和生长[38],所以在进行临床实验前需要对其安全性进行慎重检测和评估。
随着大量动物实验和临床实验的开展,Allo-BMSCs的性质、作用会进一步被阐明,体外分离和培养方法会逐步改进,安全性评估也会确立,相信在不久的将来,Allo-BMSCs将会广泛应用于临床。
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