牙周组织工程研究新进展

孙 路 综述;王永兰 审校

(天津医科大学口腔医院，天津 300070)

牙周病是一种慢性进行性疾病，可导致牙周支持组织的破坏，最终导致牙齿丧失。牙周病治疗的目的不仅在于控制炎症，更在于使已破坏的牙周组织再生以形成新附着。一般来说，完成组织的重建和修复，需要复制胚胎发育和形态发育过程，对于牙周组织则需要牙周膜、牙骨质、牙槽骨以及牙龈的再生。

牙周骨移植、引导组织再生术(guided tissue regeneration，GTR)为牙周病治疗和牙周缺损修复带来新的希望，但在恢复牙周组织的生理结构和功能上还远未达到所期望的目标。而组织工程作为重建缺失组织、产生新生组织的技术，使得实现牙周组织的完全再生成为一种可能，牙周组织工程中的三大基本要素有种子细胞、信号分子和支架材料，本文就牙周组织工程基本要素及各要素间协同作用方面内容作一综述。

1 牙周组织工程的种子细胞来源

作为组织工程三大要素之一，理想的种子细胞应具有以下特点:增殖分化传代能力强、可塑性强、植入机体后性能稳定、对受植区环境适应能力强、取材简便，对机体损伤小、无免疫排斥反应。

牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)是一组具有多向分化潜能的异质性多能干细胞，能向成纤维细胞、成骨细胞、成牙骨质细胞(cementoblasts，CBs)分化，进而形成牙周膜、牙槽骨和牙骨质，形成新的具有功能性的牙周附着结构，因此PDLSCs在牙周组织再生中是具有应用前景的种子细胞之一，并且也被大量的体内和体外临床前期实验所证实［1-3］。Trubianio 等［4］将 PDLSCs在三维支架材料上培养，向成骨性方面诱导，4周后发现部分细胞包裹在矿化基质中，表明PDLSCs能较有效地向成骨细胞(osteoblasts，OBs)分化。Liu等［5］通过外科方法在小猪第一磨牙处移除部分骨组织，随后在牙颈部周围用丝线缝合，取小猪自体的PDLSCs通过体外培养扩增移植回小猪的骨缺损处，发现PDLSCs可以再生牙周组织，为牙周炎的治疗提供了一个良好的方法。

然而，由于PDLSCs增殖分化再生的细胞数量少，并且自体PDLSCs获得困难等缺点尚不能满足于临床应用，而骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cell，BMSCs)的多重优越特性恰巧弥补其缺陷，与PDLSCs相比，BMSCs具有较强的增殖能力和多向分化潜能，来源丰富，取材简便，对机体的损失小，因此在临床上将具有广泛的应用前景［6］。BMSCs在不同的培养条件下，可分别向成骨、成软骨、成牙骨质［7］、成肌细胞等方向分化。Kim 等［8］从Beagle犬自身取得的BMSCs和PDLSCs分别与羟基磷灰石、β-磷酸三钙(hydroxyapatite/β-tricalciumphosphate，HA/β-TCP)复合植入到种植体周围缺损区，术后8周结果显示BMSCs组与PDLSCs组的牙槽骨再生量均明显高于无细胞的HA/β-TCP对照组，术后16周结果显示，BMSCs组的牙槽骨再生量高于对照组，而PDLSCs组的牙槽骨再生量与对照组无统计学差异，证明了BMSCs通过促进骨再生来治疗种植体周围缺损的可行性。

除PDLCs、BMSCs外，牙龈成纤维细胞(gingival fibroblasts，GFs)作为牙周组织的主要成分，来源丰富、容易获得、具有很强的生长和自我繁殖能力，在适当的条件下，可表达成骨细胞表型，亦有望成为牙周组织工程的理想种子细胞［9-10］。牙滤泡细胞(dental follicle stem cells，DFSCs)在体内和体外均有引导钙化的作用，因此，用DFSCs形成新骨以修复骨缺损成为一种可能［11］。Tsuchiya 等［12］研究结果表明:DFSCs与PDLSCs、BMSCs的骨形成能力没有明显差别，说明了DFSCs在骨组织工程中具有潜在的应用前景。Honda等［13］研究结果也证实了DFSCs具有促进骨形成的能力。

脂肪干细胞(adipose tissue-derived stem cells，ADSCs)是近年研究发现的一种新的成体干细胞，该细胞增殖能力强且易获得，体外培养能保持稳定的生长增殖活性，且具有向骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等多向分化潜能，有可能成为牙周组织工程新的种子细胞。研究表明很多基因具有可以降低或者提高ADSCs的分化能力，如Tbx3，Osx，骨形成蛋白等等。Lee等［14］为了确定 Tbx3在人 ADSCs的表达的作用，通过siTbx3的表达抑制Tbx3进而降低了人ADSCs的增殖能力和向成骨方向分化的能力，表明了Tbx3对于人ADSCs在增殖和向成骨方向分化的方面起着重要作用。Wu等［15］发现Osx在ADSCs的过度表达增强了骨基质蛋白的表达并且不会抑制ADSCs增殖率，同时增强了碱性磷酸酶的活性和矿化结节形成的能力，该结果表明了转染Osx的质粒促进了ADSCs向成骨方向分化并且不会影响到其增殖能力，ADSCs在骨组织工程中是有希望的种子细胞来源。

人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)是近年来干细胞研究的一个热点，这类干细胞具有多向分化潜能，可分化为多种体细胞。Inanç等［16］将人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)与牙周膜成纤维细胞共同培养，结果表明hESCs从某种程度上可定向分化为牙周膜成纤维细胞前体细胞，能够作为牙周组织工程种子细胞的来源。

2 信号分子与牙周组织工程

信号分子包括生长因子、分化因子、黏附因子等。多种生物活性分子已被证明具有较强的促进牙周组织修复的功能，包括转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)［17］、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、秞基质衍生物(enamal matrix derivative，EMD)［18-20］等。

Lee等［21］对富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)进行研究，表明适当浓度的PRP即能够促进PDLSCs和牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)的增殖，又能促进两种干细胞向矿化的方向分化，提高了碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性并增加了矿化结节的形成。同时通过Real-time PCR检测到PDLSCs、DPSCs有较高牙源性基因、成骨基因的表达。

bFGF属于肝素结合生长因子家族，具有多种生物学功能，包括血管生成、创伤修复以及胚胎发育，已有大量实验证实bFGF在骨下袋和根分叉病损区可有效的促进牙周组织再生。Shirakata等［22］分别用 bFGF、EMD、PDGF/β-TCP、翻瓣清创(open flap debridement，OPD)处理beagle犬的实验性二壁骨下袋病损区，结果显示bFGF组的骨形成量明显高于EMD和 OPD处理组，EMD和 PDGF、β-TCP两组的牙骨质和牙周韧带样组织再生明显高于OPD组，而 bFGF与 PDGF/β-TCP两组在组织学变化上无显著区别。

VEGF是一种主要的血管新生调节因子，已被广泛证明:具有极强的促血管增生能力，有研究［23］将血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和血管生成素-1(angiopoietin-1，Ang-1)基因通过两种腺病毒同时载入至hMSCs，其表达效率和产物为未转载细胞的2倍，持续时间达15 d，表达高峰时间达8 d，足以促进血管新生。

然而，外源性生长因子半衰期短，局部使用很快被稀释和代谢或因为体内酶的作用而失活，故需反复大剂量使用，而且价格非常昂贵，且外源性蛋白的植入可能引起免疫反应，基因工程的介入可克服以上缺点［24］。Tan 等［25］将 bFGF 基因转染到beagle犬的BMSCs并移植到beagle犬的根分叉病变处，6周后结果显示转染bFGF基因的BMSCs的牙周骨组织再生速度明显高于单纯移植BMSCs，有效地促进了牙周骨组织的再生。Li等［26］将转染hBMP-7基因的BMSCs复合胶原膜移植到Beagle犬的Ⅱ度根分叉病变处，术后12周通过组织学和形态学分析进行牙周组织再生的评估，发现转染hBMP-7基因的BMSCs组的牙槽骨再生量明显比未转染基因的BMSCs组的高且具有统计学意义，表明hBMP-2基因强化组织工程是治疗牙周疾病的较好的方法。

PDGF作为成骨细胞和成纤维细胞潜在的分裂繁殖和趋化因子，可刺激其胶原蛋白和非胶原蛋白的合成，调节成骨细胞中ALP活性，促进骨的矿化、诱导骨的形成，加速细胞代谢，促进牙骨质再生。Po-Chun Chang等［27］在小鼠的拔牙窝内即刻植入含有胶原基质的钛种植体，胶原基质中分别含有编码PDGF-B的腺病毒载体(adenoviral vector encoding PDGF-B，Ad-PDGF-B)、编码荧光素酶的腺病毒(Ad encoding luciferase，Ad-Luc)和rhPDGF-BB蛋白(recombinant human PDGF-BB protein)，结果显示Ad-PDGF-B和rhPDGF-BB较Ad-Luc均加快了骨修复的进程，表明在体内牙槽骨缺损中，Ad-PDGF-B基因表达在骨再生能力和体内安全性方面和rhPDGF-BB蛋白表达的作用是相同的。

3 支架材料与牙周组织工程

组织工程核心技术在于构建细胞与支架材料复合物，其中支架材料是构建组织工程化牙周组织的物质基础。支架材料的主要功能类似于细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，不仅影响细胞的附着和形态，还调控细胞的正常代谢、迁移、增殖和分化。理想的组织工程支架材料应符合以下要求［28-30］:①具有多孔性、适应的孔隙率和适宜的表面化学特性以利于细胞的附着、增殖和分化;②具有一定的机械强度③具有良好的生物相容性和生物可降解性，且其降解速率可控。目前应用于牙周组织工程中的支架材料有很多种，主要有人工合成类材料和天然生物类材料。

3.1 人工合成类材料

聚乳酸-聚羟基乙酸(Polylactide-Polyglycolide，PLGA)是 PLA(Polylactide，聚乳酸)和 PGA(Polyglycolide，聚乙醇酸)的共聚物。由于其具有易于合成、质量稳定，生物惰性、生物可降解性、降解速度可调节性和良好的可塑性等特点近些年来被大量用作控释系统的骨架材料。有研究［31］将rhBMP-2载入至静电纺丝制成的PLGA/HAp纤维支架上，且在静电纺丝过程中rhBMP-2完整性和自身结构未被破坏，rhBMP-2的释放时间可长达2～8周，其释放速率也随着HAp的含量增加而加快。

磷酸三钙(tricalciumphosphate，TCP)属于钙磷盐陶瓷，有可降解性并且释放钙磷离子促进组织矿化，是最常用于骨组织工程的生物支架材料。Stavropoulos等［32］将 β-TCP植入病人的一壁或二壁牙周骨下袋缺损区，术后6个月发现患牙的牙周探诊深度、附着丧失均有所减少，并可见新生的含有胶原纤维的牙骨质和牙槽骨。Lee等［33］将复合有重组人生长分化因子-5(recombinant human growth differentiation factor-5，rhGDF-5)的 TCP支架植入beagle犬的下颌前磨牙一壁牙周骨缺损区处，8周后处死动物经组织学观察发现rhGDF-5和TCP促进了牙骨质和骨的新生，并可见明显的板状骨形成，证明了TCP可较好地承载生长因子，是一种良好的牙周组织工程支架材料。

生物活性玻璃(bioactive glass，BG)是一种能够降解的生物材料，植入牙周组织后，BG与周围组织发生离子交换反应，出现钙磷的沉积，形成一个羟基磷灰石层，使BG与牙周骨组织形成界面愈合。Felipe等［34］采用引导组织再生术将不同直径的BG颗粒植入狗的二壁牙周骨下袋缺损区，12周后处死动物取材，组织学观察发现有显著的新骨形成，且直径较小的BG颗粒的生物降解和新骨形成能力强于直径较大的BG颗粒。

羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)与人体骨组织的无机成分相似，具有良好的化学稳定性和生物相容性，随着纳米技术的飞速发展，nHA应运而生，nHA在纳米结构上与天然骨极为接近，具有优良的生物可降解性和合适的降解速率，其良好的多孔网状结构保证了种子细胞的粘附、增殖、分化和营养代谢。Liu等［35］分别将 nHAC/PLA、复合 rh-BMP-2的nHAC/PLA、复合 DPSCs的 nHAC/PLA、复合DPSCs和rhBMP-2的nHAC/PLA以及自体骨(autogenous bone，AB)移植到新西兰兔的牙槽骨缺损处，12周后处死动物结果发现 DPSCs在nHAC/PLA上附着伸展良好并保留了成骨原型，nHAC/PLA+DPSCs+rhBMP-2组织工程骨复合体最早出现矿化并在支架内有更多的骨形成。表明了nHAC/PLA可以作为自体DPSCs的接种、增殖和分化的支架，相对自体骨移植而言，复合DPSCs和rhBMP-2的nHAC/PLA可能会成为临床牙周骨缺损重建的一个更好选择。

3.2 天然生物可降解材料

胶原(Collagen)是细胞外基质的重要组成部分，具有生物相容性好、无毒性、促进组织愈合等优点。胶原应用于牙周再生领域始于20世纪80年代初，主要用于形成屏障，防止上皮细胞长入缺损间隙，从而为成骨细胞创造空间，利于新骨长入，即引导组织再生术。Ghanaati等［36］通过小鼠模型评估一种具有双层结构的新型胶原基质生物材料，发现宿主的间充质细胞迅速长入该材料多孔的一层，而作为屏障的一层允许细胞附着和组织的整合但同时阻挡了细胞穿过。同时Ghanaati等［36］将该生物材料应用到人牙龈退缩和牙根暴露处后发现该材料成功的促进了牙龈组织的生长并减少了牙龈退缩量，该人体实验的组织学结果进一步印证了小鼠模型的发现结果，说明了这种双层胶原基质材料在人的软组织再生中具有良好的应用前景。

壳聚糖(chitosan)是甲壳素类多糖中唯一的碱性氨基多糖，其代谢产物氨基多糖为生物体所需要的物质。壳聚糖的特性在于它易与带负电的生物物质如糖蛋白等结合，成为聚电解质复合物，因此容易细胞外基质化，适合作为组织工程支架。Boynuegri等［37］将壳聚糖凝胶应用于慢性牙周炎病人的牙周骨缺损区，与单纯牙龈翻瓣手术组相比较，3、6个月后影像学资料分析显示其新骨形成量明显增多。Zhang等［38］将携带 BMP-7、PDGF-B、复合BMP-7和PDGF-B基因腺病毒载体分别接种于壳聚糖胶原支架植入狗下颌骨缺损处，4、8周和12周后可观察到携带 BMP-7、复合 BMP-7和PDGF-B基因腺病毒载体支架的两组有明显的骨形成。

藻酸盐(alginate)是从海藻中提取出的一种多糖，在钙离子的作用下交联形成网状晶格凝胶，为高含水率、高弹性和韧性的材料，其三维网状结构有利于细胞的附着及营养和代谢产物的交换。He等［39］将藻酸钙膜(calcium alginate film，CAF)作为引导骨再生膜植入兔子下颌角的骨缺损区，以传统的胶原膜(conventional collagen membrane，CCM)和不置膜作对照，术后2～6周发现实验组与对照组相比可获得更多的骨再生，术后6周与8周发现CAF组比CCM组有更多成熟的板状骨形成。说明了CAF比CCM作为可吸收性GTR膜引导早期骨的生长更有效，作为治疗骨缺损的组织工程材料有更好的应用前景。

总之，牙周组织工程技术治疗牙周缺损的修复再生有着巨大的潜力和广阔的前景，但此研究尚处于初级阶段，还有许多问题亟待解决。深入进行支架材料和种子细胞的研究和开发，构建理想的支架材料-细胞复合体;建立和完善牙周组织工程动物实验模型;选择合理的生长因子组合和研制新型载体-控释系统是牙周组织工程研究的方向;对于基因治疗应用于临床的安全性和有效性，仍有待进一步研究。同时需要多学科、跨专业的技术联合与协作，最终实现由基础实验到临床应用的转变这一目标。

［1］Kunze M，Huber A，Krajewski A，et al.Efficient gene transfer to periodontal ligament cells and human gingival fibroblasts by adeno-associated virus vectors［J］.J Dent，2009，37(7):502-508.

［2］Yang ZH，Zhang XJ，Dang NN，et al.Apical tooth germ cellconditioned medium enhances the differentiation of periodontal ligament stem cells into cementum/periodontal ligament-like tissues［J］.J Periodontal Res，2009，44(2):199-210.

［3］Du L，Yang P，Ge S，et al.Stromal cell-derived factor-1 significantly induces proliferation，migration and collagen type I expression in a human periodontal ligament stem cell subpopulation［J］.J Periodontol，2011，Jul 12.

［4］Trubiani O，Orsini G，Zini N，et al.Regenerative potential of human periodontal ligament derived stem cells on three-dimensional biomaterials:a morphological report［J］.J Biomed Mater Res A，2008，87(4):986-993.

［5］Liu Y，Zheng Y，Ding G，et al.Periodontal ligament stem cellmediated treatment for periodontitis in miniature swine［J］.Stem Cells，2008，26(4):1065-1073.

［6］Chen FM，Jin Y.Periodontal tissue engineering and regeneration:current approaches and expanding opportunities［J］.Tissue Eng Part B Rev，2010，16(2):231-233.

［7］Song AM，Shu R，Xie YF，et al.A study of enamel matrix proteins on differentiation of porcine bone marrow stromal cells into cementoblasts［J］.Cell Prolif，2007，40(3):381-396.

［8］Kim SH，Kim KH，Seo BM，et al.Alveolar bone regeneration by transplantation of periodontal ligament stem cells and bone marrow stem cells in a canine peri-implant defect model:a pilot study［J］.J Periodontol，2009，80(11):1815-1823.

［9］Chu Q，Wu F，Wang QT，et al.Influence of transfection with human transforming growth factor-beta1 gene on the osteogenic potential of the cultured human gingival fibroblast［J］.Hua Xi Kou Qiang Yi Xue Za Zhi，2009，27(3):264-267.

［10］Shin JH，Kim KH，Kim SH，et al.Ex vivo bone morphogenetic protein-2 gene delivery using gingival fibroblasts promotes bone regeneration in rats［J］.J Clin Periodontol，2010，37(3):305-311.

［11］Honda MJ，Imaizumi M，Tsuchiya S，et al.Dental follicle stem cells and tissue engineering［J］.J Oral Sci，2010，52(4):541-552.

［12］Tsuchiya S，Ohshima S，Yamakoshi Y，et al.Osteogenic differentiation capacity of porcine dental follicle progenitor cells［J］.Connect Tissue Res，2010，51(3):197-207.

［13］Honda MJ，Imaizumi M，Suzuki H，et al.Stem cells isolated from human dental follicles have osteogenic potential［J］.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2011，111(6):700-708.

［14］Lee HS，Cho HH，Kim HK，et al.Tbx3，a transcriptional factor，involves in proliferation and osteogenic differentiation of human adipose stromal cells［J］.Mol Cell Biochem，2007，296(1-2):129-136.

［15］Wu L，Wu Y，Lin Y，et al.Osteogenic differentiation of adipose derived stem cells promoted by overexpression of osterix［J］.Mol Cell Biochemm，2007，301(1-2):83-92.

［16］Inanç B，Elçin AE，Unsal E，et al.Differentiation of human embryonic stem cells on periodontal ligament fibroblasts in vitro［J］.Artif Organs，2008，32(2):100-109.

［17］Teare JA，Ramoshebi LN，Ripamo U.Periodontal tissue regeneration by recombinant human transforming growth factor-beta 3 in Papio ursinus［J］.J Periodontol Res，2008，43(1):1-8.

［18］Sculean A，Chiantella GC，Arweiler NB，et al.Five-year clinical and histologic results following treatment of human intrabony defects with an enamel matrix derivative combined with a natural bone mineral［J］.Int J Periodontics Restorative Dent，2008，28(2):153-161.

［19］Sculean A，Schwarz F，Chiantella GC，et al.Nine-year results following treatment of intrabony periodontal defects with an enamel matrix derivative:report of 26 cases［J］.Int J Periodontics Restorative Dent，2007，27(3):221-229.

［20］Rathe F，Junker R，Chesnutt BM，et al.The effect of enamel matrix derivative(Emdogain)on bone formation:a systematic review［J］.Tissue Eng Prat B Rev，2009，15(3):215-224.

［21］Lee UL，Jeon SH，Park JY，et al.Effect of platelet-rich plasma on dental stem cells derived from human impacted third molars［J］.Regen Med，2011，6(1):67-79.

［22］Shirakata Y，Taniyama K，Yoshimoto T，et al.Regenerative effect of basic fibroblast growth factor on periodontal healing in two-wall intrabony defects in dogs［J］.J Clin Periodontol，2010，37(4):374-381.

［23］Klöpper J，Lindenmaier W，Fiedler U，et al.High efficient adenoviral-mediated VEGF and Ang-1 gene delivery into osteogenically differentiated human mesenchymal stem cells［J］.Microvasc Res，2008，75(1):83-90.

［24］Elangovan S，Srinivasan S，Ayilavarapu S.Novel regenerative strategies to enhance periodontal therapy outcome［J］.Expert Opin Biol Ther，2009，9(4):399-410.

［25］Tan Z，Zhao Q，Gong P，et al.Research on promoting periodontal regeneration with human basic fibroblast growth factor-modified bone marrow mesenchymal stromal cell gene therapy［J］.Cytotherapy，2009，11(3):317-325.

［26］Li YF，Yan FH，Zhong Q，et al.Effect of hBMP-7 gene modified bone marrow stromal cells on periodontal tissue regeneration［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2010，90(20):1427-1430.

［27］Chang PC，Seol YJ，Cirelli JA，et al.PDGF-B gene therapy accelerates bone engineering and oral implant osseointegration［J］.Gene Ther，2010，17(1):95-104.

［28］Ahmed TA，Dare EV，Hincke M.Fibrin:a versatile scaffold for tissue engineering applications［J］.Tissue Eng Part B Rev，2008，14(2):199-215.

［29］Yang Y，El Haj AJ.Biodegradable scaffolds-delivery systems for cell therapies［J］.Expert Opin Biol Ther，2006，6(5):485-498.

［30］Hall H.Modified fibrin hydrogel matrices:both，3D-scaffolds and local and controlled release systems to stimulate angiogenesis［J］.Curr Pharm Des，2007，13(35):3597-3607.

［31］Nie H，Soh BW，Fu YC，et al.Three-dimensional fibrous PLGA/HAp composite scaffold for BMP-2 delivery［J］.Biotechnol Bioeng，2008，99(1):223-234.

［32］Stavropoulos A，Windisch P，Szendröi-Kiss D，et al.Clinical and histologic evaluation of granular Beta-tricalcium phosphate for the treatment of human intrabony periodontal defects:a report on five cases［J］.J Periodontal，2010，81(2):325-334.

［33］Lee JS，Wikesjö UM，Jung UW，et al.Periodontal wound healing/regeneration following implantation of recombinant human growth/differentiation factor-5 in a beta-tricalcium phosphate carrier into one-wall intrabony defects in dogs［J］.J Clin Periodontal，2010，37(4):382-389.

［34］Felipe ME，Andrade PF，Novaes AB Jr，et al.Potential of bioactive glass particles of different size ranges to affect bone formation in interproximal periodontal defects in dogs［J］.J Periodontal，2009，80(5):808-815.

［35］Liu HC，E LL，Wang DS，et al.Reconstruction of alveolar bone defects using bone morphogenetic protein 2 mediated rabbit dental pulp stem cells seeded on nano-hydroxyapatite/collagen/poly(L-lactide)［J］.Tissue Eng Part A，2011，17(19-20):2417-2433.

［36］Ghanaati S，Schlee M，Webber MJ，et al.Evaluation of the tissue reaction to a new bilayered collagen matrix in vivo and its translation to the clinic［J］.Biomed Mater，2011，6(1):015010.

［37］Boynuegri D，Ozcan G，Senel S，et al.Clinical and radiographic evaluations of chitosan gel in periodontal intraosseous defects:a pilot study［J］.J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2009，90(1):461-466.

［38］Zhang Y，Shi B，Li C，et al.The synergetic bone-forming effects of combinations of growth factors expressed by adenovirus vectors on chitosan/collagen scaffolds［J］.J Control Release，2009，136(3):172-178.

［39］He H，Yan W，Chen G，et al.Acceleration of de novo bone formation with a novel bioabsorbable film:a histomorphometric study in vivo［J］.J Oral Pathol Med，2008，37(6):378-382.