TNF-α介导的NF-κB信号通路在类风湿性关节炎血管形成中的作用

石 慧，王丹彤，乌日嘎(综述)，李鸿斌(审校)

(1．内蒙古医学院第三附属医院(包钢医院)，内蒙包头014010;2．内蒙古医学院第一附属医院，呼和浩特010010)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种不明原因的多系统性自身免疫性疾病，以关节滑膜炎、血管翳及对称性、破坏性的关节病变为主要特征。RA的病理过程有多种免疫细胞、细胞因子及细胞信号通路参与。肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factoralpha，TNF-α)是 RA 病程中最早产生的细胞因子之一，可与其他细胞因子一起促进RA滑膜血管新生。核因子κB(nu-clear factor-κB，NF-κB)是真核细胞内广泛存在的核转录因子，在细胞凋亡、病毒复制、肿瘤发生、炎症及各种免疫疾病等的基因表达中发挥了重要的作用。TNF-α刺激NF-κB信号转导通路激活在RA炎性反应、血管形成中发挥重要作用，研究此信号通路并寻找针对通路中各环节的靶向治疗对RA有重要意义。

1 TNF-α在RA中的作用

TNF是一种具有广泛生物学效应的细胞因子，按其结构分2型:TNF-α和 TNF-β，TNF-α由活化的巨噬细胞、单核细胞和T淋巴细胞产生，TNF-β由活化的T细胞和自然杀伤细胞产生，TNF中发挥主要生物学活性的是TNF-α。TNF-α通过细胞膜上的肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor，TNFR)发挥生物学活性，TNFR按相对分子质量分为两类，TNFR1(p55R)和TNFR2(p75R)，它们的胞外区都含有4个富含半胱氨酸的结构域(cysteine-rich-domain，CRD)，每个CRD由6个半胱氨酸组成，形成3对二硫键，CRD独特的结构决定了TNF-α与受体之间的特异性结合，与TNF-α结合部位是CRD2和CRD3。TNFR1和TNFR2与各自配体结合，激活特异信号通路，参与不同的效应。TNFR1在细胞损伤、成纤维细胞增殖以及细胞程序性死亡、激活NF-κB等多种生物活性的信号传递方面起重要作用;TNFR2通过与TNFR相关因子(TNFR-associated factor，TRAF)结合形成复合体激活NF-κB和JNK激酶，诱导基因转录。TNFR1和TNFR2也可共同参与完成某些生物功能。

TNF-α通过抑制骨胶原合成、刺激成纤维细胞和软骨细胞产生前列腺素和胶原酶、刺激软骨细胞分泌金属蛋白酶、升高纤溶酶激活剂的浓度、诱导外周血单核细胞分化为破骨细胞等途径，促进软骨破坏，加重炎性反应，进而促进RA的发生。在RA活动期或进展期，TNF-α呈高水平分泌。研究证实在RA患者外周单核细胞和关节滑膜液的吞噬细胞能分泌TNF-α，使外周血和关节滑液TNF-α增高。李芳等［1］测定RA患者血清TNF-α水平显著高于正常对照组，且与关节疼痛数、关节肿胀数、红细胞沉降率、C反应蛋白、类风湿因子及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)正相关，说明TNF-α与 RA活动度、滑膜炎、血管形成相关。Izquierdo等［2］比较RA、骨性关节炎与正常对照组关节镜下滑膜组织病理提示，RA患者滑膜组织含有大量不成熟的缺乏外周内皮细胞覆盖的血管，在RA早期就出现、并与时间、疾病活动性、严重性及细胞浸润程度相关，用TNF-α拮抗剂治疗后不成熟血管选择性耗尽。而骨性关节炎患者缺乏这种血管、正常组未发现这种血管。

TNF-α也可与其他细胞因子协同作用促进血管形成，它可上调 VEGF的分泌，使之通过提高血管通透性、促进纤溶酶原激活剂及其蛋白质分解酶的释放、降解毛细血管基膜、刺激内皮细胞迁移和趋化、诱使汇聚的微血管内皮细胞侵入纤维凝胶并形成管样结构等途径促进新生血管的形成，有研究表明胶原诱导性关节炎大鼠的血清 TNF-α含量与滑膜VEGF、滑膜血管增生、新生血管形成相关［3］。Cha等［4］用 TNF-α 刺激滑膜成纤维细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)，可显著增加VEGF-mRNA及蛋白表达，并呈剂量依赖性。TNF-α能刺激粒细胞巨噬细胞刺激因子、白细胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-8的产生，并激活地诺前列酮和胶原酶，引起血管生成;TNF-α与转化生长因子可产生协同效应，诱导血管生成［5］;TNF-α 能通过整合素 αvβ3完成对血管新生的作用。这些机制均参与了血管翳的生成。但Hashizume等［6］证实 TNF-α 在体外有抑制血管的作用，可能与 TNF-α在体外发生生物学活性的改变有关。

2 NF-κB通路与RA

NF-κB是由5种亚单位构成的同源或异源二聚体蛋白质，哺乳动物 NF-κB家族包括 Rel(c-Rel)、RelA(p65)、RelB、NF-κB1(p50)和 NF-κB2(p52)，细胞中最常见的NF-κB是p65/p50复合体。所有NF-κB的N末端都含有约300个氨基酸构成的Rel同源结构域(RHD)，该区域参与DNA的结合及二聚体形成。RHD的C末端含有核定位序列。IκB是NF-κB的抑制蛋白。IκB 蛋白家族包括:IκBα、IκBβ、IκBγ、IκBε、Bcl-3、p105(NF-κB1)、p100(NF-κB2)及 molecule possessing ankyrin-repeats induced by lipopolysaccharide(MAIL，脂多糖诱导性锚蛋白重复性分子蛋白)。静息细胞中NF-κB与IκB蛋白结合，使NF-κB二聚体与IκB形成的三聚体隐蔽于细胞质。IκB的N端含有Ser磷酸化位点及泛素化位点，在IκB降解时发挥重要功能;IκB的 C端有 proline，glutamate，serine，and threonine(PEST，脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸)序列，是蛋白酶作用的靶点，与IκB的降解有关，它在稳定IκB分子及抑制NF-κB与DNA结合中发挥作用。IKK(IκB kinase)是激活NF-κB经典路径的关键，由IKKα、IKKβ、IKKγ 3个亚基组成，其中IKKα和IKKβ为催化亚基，IKKγ为调节亚基。IKKα和IKKβ都含有N端的蛋白激酶结构域和亮氨酸拉链形成的环状结构域，此区域中保守位点的磷酸化会导致激酶结构的改变，从而使其获得活性。

当细胞受到TNF等刺激时，NF-κB经典通路激活，在IKK复合物和E3 IκB-泛素连接酶复合物作用下，IKKα和IKKβ亚基可特异地将IκBα分子Ser32/Ser36、IκBβ 分 子 的 Ser19/Ser23、IκBγ 分 子 的Ser157/Ser161残基磷酸化，在26S蛋白酶体系统的作用下，IKB蛋白被降解，暴露核定位序列，导致NF-κB二聚体进入胞核调节基因转录。

Woo等［7］证实RA患者滑膜组织可检测到NF-κB p65和NF-κB p50呈高表达状态，表明 NF-κB参与RA病理过程，参与滑膜、血管增生。国内外有研究表明肿瘤的血管生成与NF-κB相关，抑制NF-κB活化可有效抑制肿瘤血管形成［8-9］，而RA血管翳具有类似于肿瘤组织的特性，故抑制NF-κB也可能成为将来控制RA血管形成的有效策略。

3 TNF-α介导的NF-κB通路与RA血管形成的关系

TNF-α最重要的一个下游信号通路是NF-κB转录因子的激活，它已经被确认参与炎症、抗凋亡及免疫反应。TNF-α激活NF-κB通路有多种信号分子参与，包括 TNFR相关因子、RIP(receptor interacting protein)、MAP3K(mitogen-activated protein kinase kinase 3)、IKK复合物等。目前众多研究多集中在识别该通路的信号元件的组成、翻译后修改、亚细胞易位等方面。

3．1 TNF-α激活NF-κB的机制 在细胞表面，TNFR与其配体相结合后，可募集TNFR相关死亡结构域(TNFR-associated death domain，TRADD)，TRADD 可与 TRAF结合，活化受体相关蛋白 RIP，RIP与MAP3K相互作用使IKK的磷酸化，在活化的IKK的作用下IκBα被磷酸化，磷酸化的IκBα立即被一个泛素连接酶复合物SCF/βTrCP识别，然后被26s蛋白酶体识别并迅速降解。IκBα的降解使得核定位序列暴露出来，NF-κB活化而进入细胞核。发生核易位后，NF-κB与其目的靶基因的启动子或增强子上特定的κB系列特异结合，启动和调控RA炎性因子表达，促进滑膜血管翳形成。Calmon-Hamaty等［10］研究表明，RA成纤维细胞表达 TNF受体Ⅰ、Ⅱ，TNF-α刺激可使NF-κB表达显著增加。

3．2 TNF-α激活NF-κB促进RA血管形成的途径

TNF-α激活NF-κB信号通路诱导VEGF、组织因子和细胞间黏附分子1、血管细胞黏附分子1、环氧化酶2的表达，这些分子作用于血管内皮细胞［11-13］，促进滑膜血管翳的形成。

Cho等［14］研究报道了 CD40L-CD40系统具有与IL-1、TNF不同的信号转导通路，两者结合后通过激活下游NF-κB基因，最后启动VEGF基因的表达，为新生血管提供条件。

Scott等［15］的研究表明，TNF-α 能通过激活蛋白1和NF-κB增加RA患者成纤维样滑膜细胞中的血管生成素1(angiopoietin-1，Ang-1)mRNA的表达，促进血管发生、滑膜的增生。此级联反应可以增强炎性细胞因子(TNF-α、VEGF、IL-1等)以及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的表达，从而造成关节软骨的损伤、关节破坏。

在FLS 中，NF-κB 活化可以促进IL-1B、IL-6、IL-8、MMPs的产生，促进FLS增生，抑制FLS凋亡，从而出现滑膜血管翳形成，使细胞释放更多的细胞因子和MMPs，增强 IKKβ 的功能，引起 IκB 的降解和 NF-κB核转录［16-17］。RA患者和正常人的FLS培养结果显示，与正常人相比，RA滑膜细胞增生是通过激活TNFR相关因子，导致NF-κB活化，并阻碍了RA的FLS正常凋亡，最终使FLS的生长与死亡失衡，造成滑膜细胞过度增殖，滑膜组织增生［18］。

NF-κB是机体对于TNF-α产生生理性反应得到的重要中介物，NF-κB激活后也可以诱导TNF-α的表达、增强TNF-α基因转录，在某些细胞和组织中，NF-κB p65、TNF-α 两者相互促进［19］，形成恶性循环，加重RA发展。

4 通过阻断TNF-α介导的NF-κB信号途径来治疗RA

4．1 阻断TNF-α TNF-α抑制剂是目前被批准的用于治疗RA的生物制剂，有依那西普(etanercept)、英夫利西单抗(irdliximab)和阿达木单抗(adalimumab)。阻断TNF-α可有效切断该通路刺激信号下传。大量研究表明［20］TNF-α抑制剂可有效改善滑膜缺氧、滑膜炎症、血管形成。Wright等［21］证实RA患者中性粒细胞可表达 TNF-α的 mRNA、NF-κB，并显著高于正常对照组，经TNF-α抑制剂治疗后TNF-α回到基线水平。

4．2 阻断NF-κB级联反应

4．2．1 通过IκB 抑制NF-κB 由于IκB 的N 端含有Ser磷酸化及泛素化位点，在IκB降解发挥作用，因此，可通过阻断IκB抑制Ser磷酸化及泛素化位点IκB激活。p65小干扰RNA(p65 siRNA)可以有效地抑制p65的表达，抑制NF-κB的激活，明显减少TNF-α、IL-1β刺激软骨细胞引起的环氧化酶、一氧化氮合酶、MMP-9 的表达［22］。

4．2．2 蛋白酶体抑制剂 26 S蛋白酶体抑制剂能抑制IκB的降解、NF-κB的核内移，有望成为治疗RA的新途径。Iguchi-Hashimoto等［23］证明在RA FLS中，钙蛋白酶抑制剂可通过稳定IκB来抑制NF-κB表达，从而抑制细胞因子IL-6起到抗炎作用。

4．2．3 通过 IKK 抑制 NF-κB IKK 是 NF-κB 信号通路活化的主要调节物，抑制IKK激活来阻止IκB磷酸化从而间接抑制NF-κB信号通路激活。临床上使用的阿司匹林、布洛芬等非甾体类消炎药可抑制IKK的活性，阻止 NF-κB途径的激活。Tsuchiya等［24］用一种新型的IKK抑制剂(CHOP)作用于RA滑膜组织表明，在FLS中，CHOP可抑制TNF-α刺激的炎性因子IL-6、IL-8的表达，减轻RA滑膜炎、血管翳。

4．3 阻断NF-κB核定位 日本人 Okamoto等［25］证明丝氨酸-苏氨酸抑制剂法舒地尔可抑制adjuvant-induced arthritis(AIA，佐剂诱导性关节炎)大鼠FLS细胞因子和内皮细胞的表达，抑制炎性反应和血管形成，阻止关节炎发展，其机制是通过抑制NF-κB与特定DNA序列绑定来发挥作用，且治疗过程中无任何不良反应，对RA治疗提供有效低毒的策略。

NF-κB诱捕性寡核苷酸是含有NF-κB结合位点的双螺旋寡核苷酸，当 NF-κB 从 NF-κB-IκB 复合物中解离出来后，NF-κB诱捕性寡核苷酸即可与游离的NF-κB结合，从而封闭NF-κB，减少炎性介质的产生，减轻炎性反应和炎性损伤，在抑制肿瘤血管形成方面已有相关研究［8-9］，但对RA血管抑制作用尚不明确。

5 小结

RA早期的病理改变为持续性滑膜炎及血管翳的形成，尤其依赖于广泛新生血管网形成。血管翳具有类似于肿瘤组织的特性——侵蚀性，它可侵蚀和破坏关节软骨和骨组织，最终引起不可逆性的关节功能丧失。TNF-α介导的NF-κB通路在RA血管形成中发挥重要作用，TNF-α抑制剂已应用于临床治疗RA，并可有效减少滑膜血管化，但仍有相当数量的患者对此类药无效。所以，研究TNF-α及下游信号通路NF-κB为靶点，筛选和设计高效低毒的抗RA新药是将来研究的重点。

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