肝脏中自然杀伤细胞的表型及功能

江金华（综述），叶韵斌，陈 强（审校）

（1.龙岩市第二医院肿瘤内科，福建龙岩 364000;2.福建省肿瘤转化医学重点实验室，福州350001;

3.福建省肿瘤医院肿瘤免疫学研究室，福州350014;4.福建医科大学附属协和医院肿瘤内科，福州 350014）

肝脏中自然杀伤（nature killer，NK）细胞占很大比例，是肝内病原体感染重要的免疫调节细胞之一。肝内NK细胞的表型和功能会随着肝内微环境的改变而改变，肝内的NK细胞具有独特的细胞因子及表型。因此，改变肝内NK细胞的亚基和它们的功能可以抵抗外界持久性的感染。通过细胞与细胞之间的相互作用和细胞因子的分泌，NK细胞可以调节树突状细胞的分化和功能，进而影响T细胞的功能。现介绍肝脏具有独特功能的NK细胞表型，探讨其在适应性免疫应答中的免疫调节作用。

1 NK细胞的发育与分化

最初认为NK细胞属淋巴细胞谱系，是人体抗肿瘤和感染的第一道防线，不需预先致敏，也不受组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）的限制，能直接杀伤感染细胞及肿瘤细胞。现已证实NK细胞来源于造血干细胞，并且由NK前体细胞（NK cell precursors，NKPs）发育分化而来。在骨髓中造血干细胞可发育分化为NKPs，在胸腺中早期淋巴样前体细胞亦能够发育分化为 NKPs。近年来研究还证实肝脏、淋巴结、脾脏亦存在NKPs，表明这些组织器官也可能是NK细胞发育分化的场所［1］。在NK细胞发育分化过程中，骨髓来源的NKPs能够迁移至胸腺、淋巴结、肝脏、脾脏等部位;胸腺来源的NKPs能够迁移至淋巴结，进一步发育分化。另外，在淋巴结与脾脏之间也存在NKPs的相互迁移。在肝脏与脾脏之间是否存在NKPs的迁移尚不清楚。最早在小鼠骨髓中命名为 NKP，表型为 CD49－CD161－CD122+，NKPs进一步发育分化为不成熟NK细胞，表达部分NK细胞的特异性标志如CD161（NK1.1）和持续表达CD122+［2-4］。经过一系列的发育，未成熟的NK细胞逐渐获得表型标志，成为成熟NK细胞，表达多种细胞标志如 Ly49 受体、CD49b（DX5）、CD94、NKG2A/C，此外CD11b以及CD43的表达是NK细胞更成熟的表现［5-7］。未成熟的NK细胞通过与激活性受体结合而发育分化为具有完整功能的成熟NK细胞。NK细胞的成熟似乎是通过 MHC-Ⅰ类受体信号调节，从MHC-Ⅰ缺陷的小鼠中分离出的NK细胞比从正常小鼠中分离出的NK细胞功能更低。此外，免疫受体酪氨酸抑制基序位于MHC-Ⅰ类抑制性受体的胞尾部已被证明是NK细胞表达完整功能的关键［8-9］。特定的MHC-Ⅰ类分子是NK细胞在对激活性受体信号保持耐受的关键。

2 肝脏NK细胞亚群的独特特征

1946 年，Wisse首先描述肝NK细胞，在荷兰语里称之为 pit，中文翻译为陷窝细胞（pit cell）［9］。大量实验证实这种细胞具有自然杀伤活性，是肝脏NK细胞。与体内其他部位的NK细胞相比，肝脏NK细胞有较强的细胞毒活性和杀伤肿瘤细胞的能力。1998年，爱尔兰医师报道肝脏 NK/NKT细胞占淋巴细胞总数50%以上，是其他器官含量的5～10倍［10］。根据大鼠肝脏NK细胞颗粒的密度和大小分为高密度的大颗粒、较低密度的小颗粒，血液中高密度大颗粒NK细胞进入肝脏进一步分化成较低密度小颗粒肝NK细胞。然而，NK细胞迁移到肝脏以及参与改变NK细胞功能因子的机制还不清楚，还需进一步研究。研究证明不同分化的NK细胞具有不同表型，主要是根据CD16和CD56的表达，分为CD16－CD56Bright或CD16+CD56Dim NK细胞。CD16－CD56Bright可以产生 CD16+CD56Dim NK，CD16+CD56Dim NK 比 CD16－CD56Bright的端粒长度更短［11］。CD16+CD56Dim NK具有高细胞毒性，是人外周血NK细胞的主要组成部分，相比之下，CD16－CD56Bright NK细胞细胞毒性低，能产生大量的细胞因子（干扰素γ、肿瘤坏死因子α、粒-巨噬细胞集落刺激因子、IL-10）［12］。CD11b 和CD27表型已被用于定义小鼠 NK细胞的成熟状态［13］。CD11b－CD27+与NK细胞的成熟度呈正相关，使CD11b－CD27+NK到CD11b+CD27+NK，并进一步到CD11b+CD27－NK。功能方面，CD11b－CD27+NK细胞虽然比CD11b+CD27+NK产生更多的细胞因子，但细胞毒性较低。CD11b+CD27－表达较高水平的杀伤细胞凝集素样受体1，诱导 NK细胞的活化和增殖［14］。CD11b－CD27+NK主要存在肝脏中，血液里主要是CD11b+CD27－。因此，通过对NK细胞在不同组织的分化和成熟的研究，可以为感染性疾病和恶性肿瘤患者提供新的免疫疗法。

3 NK细胞受体及功能

成熟的NK细胞表型为CD16+CD4－CD8－，其功能的发挥主要依赖于能与MHC或非MHC类配体结合的NK细胞受体，并传递抑制或激活信号，调节NK细胞的活性（Ly49和NKG2）。小鼠体内几个NK细胞受体已确定是Ly49受体家族［15］。Ly49Ⅱ型受体跨膜表达与NK细胞形成二硫键相连的二聚体的糖蛋白，大多数Ly49受体是抑制剂受体，识别MHC-Ⅰ及MHC-Ⅰ类分子［16］。与此相反，许多激活Ly49受体的配体仍不清楚。人类NK细胞与Ly49功能同源性的受体被称为杀伤细胞免疫球蛋白样受体，NK细胞受体与Ly49受体结构不同，包括激活及抑制性受体。Ly49及杀伤细胞抑制性受体家族具有多样性［17］。NKG2属C型凝集素超家族成员，在小鼠及人体中均有表达，包括NKG2A、C和E，在人类也表达NKG2F，并与 CD94作为二聚体存在 NK细胞表面［18］。NKG2A是一种抑制性受体，在胞质尾携带两个免疫受体酪氨酸抑制基序，而NKG2C和E受体通过接头蛋白 12参与激活［19］。在小鼠实验中，NKG2A高表达，NKG2C和E低表达。NKG2受体的表达受炎性刺激，尤其是IL-10和转化生长因子P能够诱导NKG2A的表达，通过局部调节NK细胞，对炎性刺激作出反应［20］。肝脏内NK细胞免疫耐受，有利于某些热带病原体持续感染。在研究活化性及抑制性受体在肝脏NK细胞的功能中发现，肝脏中主要表达的 NKG2A+NK细胞缺乏 Ly49受体的表达，NKG2A+Ly49－NK细胞亚群对IL-12/IL-18反应低。此外，脾脏NK细胞迁移植到肝脏后，表型和功能倾向于肝内的NK细胞［21］，肝环境可以改变NK细胞受体表达和对细胞因子的刺激的反应性，优先保留肝脏内未成熟的NK细胞。虽然NKG2D作为NKG2受体的一部分，但和其他 NKG2受体很少同源性，NKG2D不绑定CD94，老鼠和人类NK细胞受体主要以二聚体形式存在［22］。NKG2D是一个重要的激活性受体，在所有NK细胞上均有表达，通过识别、结合感染细胞应激细胞表面诱导表达的配体传递活化信号，激活或协同激活NK细胞对靶细胞发挥杀伤作用。NKG2D有两种异构体:长胞质尾NKG2D-L和短胞质尾 NKG2D-S。研究表明［22］，NKG2D-S既能与接头蛋白10又能与接头蛋白12结合，而NKG2D-L只能与接头蛋白10结合。NKG2D通过与不同转接蛋白结合来传递协同刺激信号或完全激活信号。静止的NK细胞仅表达NKG2D-L，经体外IL-2活化或体内poly-Ic激活的NK细胞都有NKG2D-s转录功能。因此，在活化的NK细胞中NKG2D受体同时依赖免疫受体酪氨酸抑制基序及蛋白激酶抑制剂3激酶通路，提供完全激活信号和协同刺激信号。值得注意的是，NKG2D几乎在所有的NK细胞中都能表达，其表达水平受细胞因子环境调节，IL-15和肿瘤坏死因子α增加NKG2D的表达，转化生长因子β则下调NKG2D的表达。NKG2D是C型凝集素超家族中的一员，是迄今为止被鉴定出相应配体的一类非常重要的非MHC型活化性受体。NKG2D-L很多，在人类主要有人类组织相容性复合体Ⅰ类相关基因A/B及人UL16结合蛋白等。NKG2D-L相对局限在恶性肿瘤细胞、病毒感染的细胞及其他受到“应激性刺激”的细胞上，且NKG2D与其配体（NKG2D-L）结合的亲和力也比免疫系统中其他任何配体、受体之间结合的亲和力高。研究表明，NKG2D、NKG2D-L系统激活肿瘤免疫监督，因此NKG2D受体与配体的相互作用对肿瘤细胞免疫监视尤其重要［23］。活化型受体主要包括自然细胞毒性受体、2B4（二磷酸尿核苷葡萄糖醛酸基转移酶2家族肽B4）、DNAM21（m21基因）受体等。人类NK细胞受体可分为免疫球蛋白超家族和C型凝集素超家族两大类。自然细胞毒性受体包括NKp46、NKp44和NKp30，其表达与细胞毒性呈正相关。NKp46表达于静息细胞，NKp44仅表达于活化细胞，NKp30表达于所有的NK细胞。

4 调节NK细胞功能的重要因素

NK细胞通过直接杀伤或释放穿孔素、颗粒酶与肿瘤坏死因子家族配体，即FasL、肿瘤坏死因子和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体杀死肿瘤细胞，或者通过分泌许多效应性细胞因子，如干扰素γ、肿瘤坏死因子、IL-5、IL-13、粒-巨噬细胞集落刺激因子等。另外，NK细胞还能激发继发免疫，可调节NK细胞的细胞因子，通过激活受体参与细胞因子的分泌，并产生后续的适应性免疫反应。除了交叉连接激活受体，IL也可以诱导NK细胞活化为类细胞因子，包括类ⅠIFNs、IL-2、IL-12、IL-15 和 IL-18。此外，IL-15 参与了NK细胞的增殖。更重要的是，NK细胞表达的Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）是识别病原体相关分子模式的关键，TLR刺激可导致干扰素γ的生产，并可以上调CCL3、CCL4、CCL5趋化因子，尤其是TLR-3激活可增强NK细胞的细胞毒效应并诱导产生细胞因子［24］。因此，TRLS可能是使肝脏中的NK细胞NKG2D保持低水平表达的关键。TLR的刺激使NKG2D上调，巨噬细胞上NKG2D的配体是TLR-4。因为从肠道来源的大量脂多糖对肝脏具有很大的危害，因此这种相互作用使肝脏中的NK细胞NKG2D保持低水平。最近报道，补体和TLRs间的作用抑制了IL-12的产生，从而削弱了NK细胞的过度活化。因为肝脏是产生补体及蛋白质主要脏器，所以TLR联合补体对肝脏NK细胞的功能具有重要意义［25］。肝内巨噬细胞（即库普弗细胞）是清除血液中的内毒素的关键，库普弗细胞也可能在维持肝脏的耐受性发挥重要的作用。虽然整个肝脏库普弗细胞都有存在，但主要是汇管区周围地区。库普弗细胞在清除脂多糖时产生高水平的IL-10，这项研究还表明IL-10在维持肝脏的耐受性的重要作用，也进一步表明，库普弗细胞可诱导IL-10的生产，并降低NK细胞的活性。EAE小鼠模型发现，通过中枢神经系统NKG2A/Qa-1b的相互调节，NK细胞能将小胶质细胞杀死［26-27］。高表达的 NKG2A在肝脏NK细胞功能的调节中发挥同样重要的作用。

5 NK细胞的免疫调节功能

最近，研究者对NK细胞在调节宿主的整体免疫作用的认识已大大增加。通过大量的细胞因子引发NK细胞的免疫反应，进而激活固有免疫细胞引发炎性反应。NK细胞在适应性免疫应答中起到了关键作用。T细胞反应是通过NK-DC串话，DC细胞成熟和分泌细胞因子/趋化因子的结果［28-29］。同时，NK细胞也已被证明是一种选择性杀伤的巨噬细胞，DC和（或）T细胞抑制了适应性免疫反应［30］。NK细胞在调节宿主免疫表现出众多的功能。尚未证实是NK细胞亚基及功能的整体变化而决定。通过对NK细胞调节宿主免疫机制的深入了解，NK细胞对提高宿主免疫，对抗感染和肿瘤意义重大。NK细胞在肝脏的淋巴细胞中占很大的比例，NK细胞通过与不同的细胞之间的相互作用而保持免疫耐受。有趣的是，与肝细胞共同培养的NK细胞具有改变DC的能力，以CD4+T细胞为主。此外，在与肝细胞共培养中DC诱导的T细胞调节表型主要是依赖于NK细胞NKG2A参与完成［31］。在慢性丙型肝炎患者的 NK细胞NKG2A的表达增加了，提示持续性病毒感染中NKG2A的作用，表明肝脏NK细胞可能会抑制具有抗病毒作用的T细胞反应和促进病原体感染的持久性。也有报道新鲜分离的丙型肝炎患者的NK细胞中有高水平的 IL-10［32］。

6 结语

肝脏天然的免疫耐受性对每天大量肠源的外来抗原不产生炎性反应，在肝脏内持续存在。NK细胞不仅在先天免疫系统中，而且在适应性免疫反应中发挥重要作用，而肝内NK细胞功能保持着低反应状态，与脾脏 NK细胞相比，肝脏 NK细胞对 IL-12/IL-18刺激产生较低的干扰素γ。肝脏中低效应的NK细胞表达高水平的抑制性受体NKG2A而不表达MHC-Ⅰ/Ly49受体。基于这一发现，过继转移至肝脏的脾NK细胞在肝内的环境下改变其表型和功能，如何使肝内保持大量低反应的NKG2A+Ly49－NK细胞，可为抗肝内感染及肿瘤提供重要依据。

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