鸡肠道中植物乳杆菌JX98所产细菌素的理化特性研究

黄微薇

鸡肠道中植物乳杆菌JX98所产细菌素的理化特性研究

黄微薇

从鸡肠道内容物中分离筛选出1株产细菌素的菌株，通过生理生化法和16S rRNA测序分析进行鉴定。采用牛津杯法对抗菌肽的抗菌谱进行研究，利用N－羟甲基甲基甘氨酸－SDS－PAGE电泳确定细菌素的相对分子质量。

植物乳杆菌素;细菌素;理化特性

乳酸菌素是某些乳酸菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有生物活性的蛋白质、多肽或前体多肽，可以抑制食品中的致病菌和腐败菌，包括蜡状芽孢杆菌、肉毒梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌等，不仅可以改善肠道生态，而且是一类具有潜在开发能力的天然食品防腐剂和饲料添加剂。［1－2］而且与抗生素相比，细菌素是由安全的食品级微生物产生的，而且作为蛋白或多肽类物质可以被肠道系统的水解蛋白酶分解，对肠道微生物菌群没有不利影响。［3］

本文从鸡肠道中分离筛选出1株产细菌素菌株，经生理生化实验和16S rRNA鉴定，该菌株为植物乳杆菌JX98，并研究该菌株所产植物乳杆菌素JX98－1的理化特性，为开发安全高效食品生物防腐剂奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料。

供试菌株:从鸡肠道内容物中分离产细菌素菌株1株，经生理生化实验和16S rRNA进行鉴定该菌株为植物乳杆菌JX98。将该菌株于MRS培养基中培养。

主要药品:胰蛋白酶(Sigma)、胃蛋白酶(Sigma)、过氧化氢酶(Sigma)、淀粉酶(Sigma)、蛋白酶K(Sigma)

1.2 方法。

1.2.1 抑菌实验。将待测植物乳杆菌JX98在37℃恒温培养箱中培养18h，以2%的接种量接入MRS培养基中37℃恒温培养24h，将发酵液在10000r/min离心5min，取上清液，将上清液的pH调为6，备用。

制作10mL含琼脂2%的营养琼脂平板。指示菌培养过夜，制备含0.8%琼脂指示菌培养基，接种1mL指示菌，将10mL含有指示菌的软琼脂培养基倾倒在事先倒好的琼脂培养基上，将预先灭菌的牛津杯放上，在牛津杯的空中加入100μL发酵上清液，在无菌操作台中静止1h，让后放入恒温培养箱中37℃培养48h，测抑菌直径(mm)。［4－6］

1.2.2 酶敏感实验。在胰蛋白酶(Sigma)、胃蛋白酶(Sigma)、过氧化氢酶(Sigma)、淀粉酶(Sigma)、蛋白酶K(Sigma)的最适pH值下处理发酵上清液，各酶的终质量浓度是1mg/mL，37℃水浴2h后，调回pH值6.0，采用打孔法做抑菌试验。对照为未做处理的pH6.0的发酵上清液。［5，6］

1.2.3 稳定性实验。将植物乳杆菌JX在30℃、37℃和43℃添加下培养，并分别取上清液，将发酵上清液pH值分别调至 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 抑菌实验，分别检测菌活性AU/mL，指示菌为大肠杆菌。［7］

1.2.4 电泳法确定细菌素的相对分子量。采用硫酸铵沉淀法初步纯化发酵上清液中的细菌素.将沉淀的细菌素重悬于10 mmol/L磷酸盐缓冲液中。蛋白电泳采用两层胶，即浓缩胶4%，分离胶16.5%。电泳结束后.将胶切成两半，将带有Marker的一半胶染色脱色，另一半用双蒸水漂洗干净后，小心地铺在接有单核细胞增生李斯特菌的TSBYE固体培养基上，37℃培养12h，与染色的半块胶对比，确定其相对分子质量。［8］

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌素JX98－1的抑菌活性。

由表1可以看出，植物乳杆菌素JX98－1对大肠杆菌(Escherichia coli)、厌氧性链球菌(Streptococcus agalactiae)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)有很强的抑菌效果抑菌直径在16～20mm。对干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)有一定的抑菌效果，抑菌直径在6～9mm，对粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)抑菌效果不明显。

表1 植物乳杆菌素JX98－1的抑菌谱和指示菌的培养条件Table1 Growth media and incubation temperatures of indicator strains，and inhibitory spectrum of plantaricin JX98－1

注:“+”表示抑菌直径为6～9mm;“++”表示抑菌直径为10～15mm;“+++”表示抑菌直径为16～20mm;“－”表示抑菌直径小于6mm。

2.2 酶敏感性实验。

由图1可知，发酵上清液用胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K处理后抑菌圈小于2mm，而用过氧化氢酶处理的发酵上清液和未做处理的发酵上清液做抑菌实验，其抑菌圈直接为12mm，说明发酵上清液中存的抑菌物质为蛋白类物质细菌素，而非过氧化氢酶。发酵上清液用淀粉酶处理后抑菌圈直径为8mm，抑菌直径有所缩小，说明此细菌素的抑菌活性由糖基化修饰。

图1 植物乳杆菌素JX－1对酶的敏感性实验Fig.1 Effects of enzyme treatments on the antimicrobial activities of plantaricin JX98－1

2.3 细菌素相对分子质量。

将初步纯化的细菌素样品，通过N－羟甲基甲基甘氨酸－SDS－PAGE电泳后，与Marker条带对比，如图3可知此细菌素的相对分子质量约3.7ku。

图3 植物乳杆菌素JX98－1的N－羟甲基甲基甘氨酸－SDS－PAGE电泳图Fig.3 Tricine－SDS－PAGE of plantaricin JX98－1

3 结论

从鸡肠道内容物中分离并经筛选、鉴定、抑菌试验得到具有抑菌活性的植物乳杆菌1株，命名为JX98。对该菌株所产细菌素进行抑菌谱、酶敏感、温度、pH实验，发现该细菌素对大肠杆菌(Escherichia coli)、厌氧性链球菌(Streptococcus agalactiae)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)有很强的抑菌效果抑菌直径在16～20mm。对干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)有一定的抑菌效果，抑菌直径在6～9mm，对粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)抑菌效果不明显。植物乳杆菌素JX98－1对胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K敏感，说明该细菌素有很强的蛋白质性质。植物乳杆菌素JX98－1在pH5～6，温度37℃下有较高的活性，其活性范围在8800－7800 AU/mL之间。植物乳杆菌素JX98－1的分子量为3.7ku。

［1］沈莲清，苏光耀，王向阳.植物乳杆菌素研究进展［J］.食品与生物技术学报，2006，25(5):35－38.

［2］周伟，刘国荣，李平兰，戴蕴青.周康植物乳杆菌素L－1对单核细胞增生李斯特氏菌作用机理的研究［J］.微生物学报，2007，47(2):47－51.

［3］周伟，李平兰，周康，吕燕妮.温度、pH及盐对植物乳杆菌素L－1作用单核细胞增生李斯特氏菌的影响［J］.食品科学，2006，27(2):100－104.

［4］刘书亮，张艾青，田刚，蒲彪，胡欣洁.植物乳杆菌P158的生长曲线及其细菌素的特性［J］.核农学报，2009，23(6):85－92.

［5］杨雪海，赵娜，魏金涛，李绍章.植物乳杆菌对致病性大肠杆菌的抑制效果研究［J］.饲料研究，2011(1):70－74.

［6］李景良，宋达峰.顾青植物乳杆菌ZJ316生产细菌素［J］.微生物学报，2008，48(6):187－192.

［7］李想，王然，程建军，李琦，王鹏.植物乳杆菌培养基的优化［J］.东北农业大学学报，2008，39(9):201－204.

A Study on Characteristics of Lactobacillus Bacteriocin JX98 from Chicken Cecal

Huang Weiwei

One bacterial strains were isolated from chicken cecal contents and identified basing on physiological and biochemeical characteristics determination，and 16s rRNA sequencing analysis.Oxford cup test was applied to assay the antimicrobial spectrum.

lactobacillus;bacteriocin;physical and chemical properties

Q939.11+7

A

1672－6758(2012)02－0048－2

黄微薇，硕士，助教，鸡西大学，黑龙江·鸡西。邮政编码:158100

Class No.:Q939.11+7Document Mark:A

(责任编辑:郑英玲)