牙周致病菌内毒素耐受的研究进展

孙梦君 综述;孙 颖，徐 艳 审校

(南京医科大学口腔医学研究所，南京医科大学附属口腔医院牙周科，江苏 南京 210029)

内毒素(endotoxin)又称脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，是G-菌细胞壁外膜的重要组成成分，可引起一系列的炎症反应，在G-菌感染中起重要作用。LPS反复刺激可能引起机体对后续刺激的反应性降低，产生耐受现象，即内毒素耐受(endotoxin tolerance)，是机体防御机制的重要组成部分。在牙周炎发生发展过程中，牙周组织持续暴露于各种不同的细菌和毒性产物环境中，其诱导的耐受反应可能是宿主下调炎症反应，避免组织损伤的途径之一［1］。近年来，有关牙周致病菌内毒素耐受的研究已有较多报道，本文就这方面的研究进展作一综述。

1 内毒素耐受和交叉耐受(cross tolerance)

目前，关于内毒素耐受的研究多集中于单核/巨噬细胞，主要表现为选择性的基因和蛋白表达水平的改变，其中大部分表达下调的都是炎症因子，例如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素 -1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6和IL-12，以及趋化因子，例如 CCL3、CCL4和 CXCL10;表达上调的主要是抗炎因子，例如IL-10、转化生长因子 -β(transforming growth factor-β，TGF-β)和IL-1受体拮抗剂(interleukin-1 receptor antagonist，IL-1RA)等［2-3］。就功能而言，耐受细胞主要表现为抗原提呈能力受损，但吞噬能力增强(表面受体CD64表达上调)，杀灭内吞的病原体的能力不受影响或减弱［4］。除了单核/巨噬细胞，内毒素耐受还可能发生在其他免疫细胞，例如树突状细胞和中性粒细胞，以及部分组织细胞，例如肠上皮细胞［5-6］。另外，内毒素耐受现象在动物模型和人体中也有报道［7-8］。

研究发现:牙周炎病人的牙龈组织可能处于内毒素耐受状态，尽管TLR2、4阳性细胞浸润增多，但是 TLR2、4 mRNA表达水平却是下调的［1］。另外，从牙周炎病人牙龈组织中分离的单核细胞也处于内毒素耐受状态，与健康对照相比，他们上调TLR2、4 和 IL-1β 的能力下降［9］。

内毒素耐受并不是特异性的，不同的LPS，甚至与LPS不具备结构同源性的刺激物也可诱导细胞对后续LPS的刺激产生耐受，即交叉耐受。例如大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)LPS和牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，Pgs)LPS可以相互诱导耐受［10］;TNF-α预刺激可使后续LPS刺激引起的炎性因子分泌减少，小鼠死亡率降低［8］。

2 内毒素耐受的机制

内毒素耐受的机制与Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)信号传导有关，TLRs是一种表达于哺乳动物和人体细胞表面的模式识别受体，可以识别微生物的保守结构，即病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)。TLRs识别PAMPs后可以启动胞内信号转导途径，刺激细胞产生炎性细胞因子、共刺激分子和主要组织相容性复合物Ⅱ(major histocompatibility complex classⅡ，MHC Ⅱ)，从而启动获得性免疫反应［11］。

目前，已发现13种不同的TLRs，而不同TLR与不同配体识别有关。TLR2可以识别肽聚糖、脂磷壁酸、脂蛋白、以Pg为代表的某些G-菌的LPS和Pg菌毛等毒力因子;TLR4主要识别以E.coli为代表的绝大多数G-菌的LPS［11］。

内毒素耐受的发生可能涉及TLRs信号途径中的多种受体、转接分子、信号分子和转录因子表达水平的改变，例如TLR2、4表达下调;IL-1受体相关激酶-1、4(interleukin-1 receptor-associated kinase-1、4，IRAK-1、4)的降解;丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)和核因子 -κB(nuclear factor-kappa B ，NF-κB)的活化受损等［1，5］。TLRs信号传导途径的负性调节因子在内毒素耐受中也可能发挥了重要的作用，例如IRAK-M、含Src同源区2的肌醇磷脂酶(Src homology 2 containing inositol phosphatase，SHIP)和细胞因子信号抑制物-1(suppressor of cytokine-signaling-1，SOCS-1)等［3-4，8-9］。最近研究发现:染色质修饰和小RNA干扰也可能与内毒素耐受有关［12-13］。

3 牙周致病菌与内毒素耐受

3.1 Pg

Pg是牙周主要致病菌之一，常从慢性牙周炎病人的牙周袋中分离得到，可以诱导中性粒细胞、单核/巨噬细胞产生多种促炎因子。大量证据表明:Pg LPS 主要通过 TLR2 传递信号［11，14］。但也有报道称:Pg LPS可以活化 TLR4［15］。引起这些差异的主要原因可能是Pg LPS在提取过程中被其他可以活化TLR4的物质污染，或其脂质A结构改变导致TLR活化特性改变。

Pg LPS诱导内毒素耐受的能力弱于 E.coli LPS。Zaric等研究发现:E.coli LPS重复刺激后，THP-1细胞分泌的IL-8和TNF-α明显减少，小鼠骨髓来源巨噬细胞分泌的角质形成细胞衍生细胞因子(keratinocyto-derived Cytokine，KC)、巨噬细胞炎性蛋白2(macrophage inflammatory protein 2，MIP-2)和TNF-α减少，但Pg LPS重复刺激后，仅TNF-α减少，而 IL-8、KC 和 MIP-2 分泌持续增多［10］。采用E.coli LPS重复刺激THP-1细胞后，细胞产生的IL-1β和TNF-α都减少;而Pg LPS重复刺激后，仅 IL-1β 减少，TNF-α 不变甚至增多［14］。

Pg LPS和E.coli LPS诱导内毒素耐受的能力不同，可能与两者在一次和二次刺激时对TLRs表达的影响不同有关。Muthukuru等发现:E.coli LPS重复刺激诱导TLR2、4 mRNA和蛋白下调的能力均强于 Pg LPS［1］。Martin 认为:E.coli LPS 刺激后，THP-1细胞表面TLR4表达明显下调，而Pg LPS刺激后，TLR2 明显上调［14］。Hajishengallis等也认为:Pg LPS刺激细胞后引起的TLR2表达上调可能与再次刺激后TNF-α的增多有关［16］。

Pg LPS和 E.coli LPS诱导 NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，I-κB)降解和 NF-κB 活化的能力不同，可能也与其诱导内毒素耐受的能力不同有关。Martin等采用E.coli LPS重复刺激后，细胞降解I-κB-α和I-κB-β的能力下降，但Pg LPS重复刺激后，细胞保持了降解I-κB-β的能力［14］。Zaric等则认为Pg LPS重复刺激后仍能诱导细胞IκB-α 降解［10］。Hajishengallis 等采用 E.coli LPS预刺激，E.coli LPS或 Pg LPS再次刺激后，NF-κB p50和p65亚基都下调;而Pg LPS预刺激，E.coli LPS或Pg LPS再次刺激，NF-κB p50和p65亚基都上调［16］。由于Pg LPS重复刺激后，细胞仍能有效降解部分I-κB，活化NF-κB，因此，其诱导的某些炎性因子的下调可能与NF-κB无关，而存在其他调节机制。Zaric认为Pg LPS重复刺激后，细胞产生TNF-α减少可能是因为TNF-α启动子区组蛋白H3的二甲基化引起了基因沉默［10］。Hajishengallis则认为Pg LPS重复刺激后IL-1β的下调可能是因为Pg LPS诱导产生了IL-1RA，可以阻止IL-1β与IL-1R结合，抑制IL-1β的正反馈回路，从而下调 IL-1β［16］。

Pg LPS诱导的耐受可能影响抗原提呈细胞的功能。Cohen等采用Pg LPS重复刺激人单核细胞、树突状细胞和 THP-1细胞后，共刺激分子CD80、CD86表达下调，趋化因子CCL3和CCL5也受到抑制［17］。Muthukuru等也发现:Pg LPS重复刺激人外周血单核细胞来源的巨噬细胞后，细胞对Pg的摄取能力增强，但是，耐受细胞中的人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)-DR和共刺激分子CD40、CD86表达下调，诱导自体CD4加T细胞增殖的能力也减弱［18］。这些研究表明:Pg LPS引起的耐受虽然有利于避免过度的炎症性组织损伤，但可能减弱了抗原提呈细胞的提呈功能，从而抑制了牙周炎病人的适应性免疫反应。

另外，Ara等采用Pg LPS重复刺激人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblast，HGF)，发现细胞分泌IL-6和IL-8未下调，也不表达负性调节因子SOCS-1、IRAK-M和SHIP-1。由此认为，HGF在Pg LPS重复刺激后不产生耐受，可能在维持牙周炎症中发挥了一定作用［19］。

3.2 伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans，Aa)

Aa是另一种牙周主要致病菌，与侵袭性牙周炎的发生发展密切相关，其LPS主要通过TLR4传递信号。Gloria等采用CD14、TLR4和TLR2抗体对HGF进行预处理发现，只有CD14和TLR4抗体可以抑制Aa LPS诱导的胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)1/2 磷酸化，而TLR2抗体不能，提示CD14和TLR4在识别Aa LPS 中起重要作用［20］。

Aa LPS诱导的内毒素耐受对各种炎性因子的调节作用不同。Tanabe等发现:Aa LPS重复刺激人巨噬细胞后，TNF-α分泌减少，而IL-1β、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)分泌增多，IL-6、IL-8和前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)则保持不变。因此推测:Aa LPS重复刺激可能参与调节牙周组织的炎症状态，与疾病的间歇性相关［21］。Nakamura等采用小剂量Aa LPS对健康全血样本进行预刺激，再次刺激时其分泌的IL-1β和IL-6明显增多，IL-10和TNF-α虽增多，但没有显著差异。流式细胞检测分析胞质内染色显示，单核细胞是产生IL-1β和IL-6的主要细胞，其次是多形核中性粒细胞，淋巴细胞未见染色［22］。这些研究表明:Aa LPS重复刺激后，尽管一些特异性促炎因子分泌减少，但也有一些炎症介质或组织降解酶增多。因此，Aa LPS是否可以诱导耐受，这种耐受对于宿主究竟是有利还是有害，仍不能下定论。

关于Aa LPS诱导耐受的机制研究较少，Tanabe等在诱导耐受时加入磷脂酰肌醇-3’-激酶(Phosphatidylinositol-3’-kinase，PI3K)抑制剂，抑制了Aa LPS重复刺激后IL-1β的增多，但对TNF-α无影响，进而推断，Aa LPS重复刺激人巨噬细胞后，IL-1β和TNF-α的分泌可能是通过不同的信号途径进行调节的［21］。

3.3 齿垢密螺旋体(Treponema denticola，Td)

Td是一种G-厌氧螺旋体，与牙周炎和坏死性溃疡性龈炎有关，其在牙菌斑中的数量与牙周病的严重性相关。Gabriel等发现:小鼠巨噬细胞通过TLR2识别 Td及其主要外鞘蛋白(major outer sheath protein，MSP)，通过TLR4识别其脂寡糖(lipooligosaccharide，LOS)。采用干扰素 -γ(gamma interferon，IFN-γ)或增加Td的量可使细胞在缺乏TLR2的情况下活化。因此认为:Td可以通过TLR2活化小鼠巨噬细胞，但也存在另一种受体，这种受体识别依赖于感染部位螺旋体的量及IFN-γ的水平［23］。

研究发现:Td表面成分可诱导产生内毒素耐受。Gabriel等发现LOS和MSP都可诱导小鼠巨噬细胞对后续的明尼苏达沙门菌LPS刺激产生耐受，使细胞分泌的一氧化氮减少。因此推测Td表面成分诱导的耐受可能是混合感染时细菌逃避清除的机制之一［23］。

综上所述，目前对于牙周致病菌内毒素耐受的研究主要集中于Pg，对其他致病菌的研究相对较少。牙周组织内毒素耐受的体内研究较少，体外研究则主要集中于免疫细胞，对牙周组织细胞的研究相对较少。另外，各研究之间存在较大的差异性，可能与使用的LPS类型和剂量、细胞类型以及检测时间不同等有关。内毒素耐受在减轻组织损伤的同时也不利于感染的控制，对于牙周组织的健康究竟是有利还是有害，仍不能下定论。上述问题还有待将来深入的研究。

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