2-S-羧甲基-1-甲基咪唑的合成、表征及其应用

唐伟伟，王俊平，王硕

（教育部食品与营养重点实验室天津科技大学，天津 300457）

2-S-羧甲基-1-甲基咪唑的合成、表征及其应用

唐伟伟，王俊平，王硕*

（教育部食品与营养重点实验室天津科技大学，天津 300457）

以甲巯咪唑和溴乙酸为原料，合成了2-S-羧甲基-1-甲基咪唑，并对其进行MS和1H NMR验证，然后以此化合物作为半抗原来合成甲巯咪唑酶标记抗原，然后利用分子印迹技术在酶标板上直接聚合制备仿生抗体，最后利用直接竞争酶联免疫吸附测定法测定猪肉样品中甲巯咪唑的残留。2-S-羧甲基-1-甲基咪唑的产率为73.8%～95%，IC50和IC15分别为（100±4）μg/L和（1.1±0.04）μg/L猪肉样品中的甲巯咪唑回收率为77%～89%。且测定结果与HPLC方法具有良好的一致性。

甲巯咪唑；溴乙酸；表征；酶标抗原；仿生酶联免疫

甲巯咪唑有增进蛋白质代谢、提高瘦肉率的作用，因此会被不法者添加到动物饲料中，动物经此类饲料饲喂后在尿液、肌肉及组织中会有不同程度的残留。人在食用了残留有甲巯咪唑的动物性食品后会造成甲巯咪唑在人体内的蓄积，从而产生蓄积毒性作用如膜性肾病、急性造血功能停滞[1]。

现在检测甲巯咪唑的方法有薄层色谱法（TLC）[2]，气相色谱-质谱法（GC-MS）[3-4]，高效液相色谱法（HPLC-UV）[5-7]，质谱法（MS）[8]、毛细管电泳法（CE）[9-10]和分子印迹法[11]。但是还鲜见利用酶联免疫吸附测定法来检测动物源性食品中残留的甲巯咪唑的报道。利用酶联免疫吸附法最重要的一点就是半抗原的合成，然后进一步合成酶标抗原和免疫原。然而合成甲巯咪唑半抗原的报道并没有见到。众所周知，半抗原与载体蛋白连接必须有3个基本条件：半抗原的化学结构上必须带游离氨基或游离羧基或者二种基团皆有，本文研究用活化酯法合成甲巯咪唑酶标抗原所需要的半抗原的两种合成方法。合成机理见图1。

图1 2-S羧甲基-1-甲基咪唑合成路线Fig.1 Reaction scheme for the synthesis of 2-S-carboxymethyl-1-methyl iminazole

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

旋蒸仪：瑞典Buchi公司；SHB-IV型双A循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；BL-610分析天平：美国Sartorius公司；AV-400核磁共振仪：布鲁克公司；LCQ Advantage液相色谱-质谱联用仪：美国Thermo公司。

溴乙酸：国药集团（上海）化学试剂有限公司；甲巯咪唑：99.7%，北京燕京药业有限公司；浓盐酸：北京化工厂；氢化钠：天津市北斗星精细化工有限公司；氢氧化钠：天津市北方天医化学试剂厂；四氢呋喃：色谱纯，德国Merck公司；甲醇：色谱纯，天津康科德公司。

试验前先将四氢呋喃做脱水处理。

1.2 2-S羧甲基-1-甲基咪唑的制备

甲巯咪唑的分子结构上具有一个-CH3和一个-SH，本试验拟用溴乙酸与甲巯咪唑的巯基反应，接上一个游离羧基的臂，即合成出了2-S羧甲基-1-甲基咪唑。

1.2.1 方法一

称取5 g NaOH溶于40 mL水中，然后加入6.85 g甲巯咪唑，磁力搅拌15 min。15 min后，加入9 g溴乙酸，回流2 h。

待回流装置冷却后，用浓盐酸将回流后的液体酸化至pH=1，然后加入等体积的乙酸乙酯萃取，重复萃取三次，收集有机相40℃减压旋蒸，最终得到红色油状物质，TLC（乙酸乙酯:甲醇=5:2），Rf=0.7。柱层析收集后面的成分，再40℃减压旋蒸，最终得到红色固体。收率为73.8%。

1.2.2 方法二

用分析天平准确称取5.71 g甲巯咪唑，然后将其溶解于装有20 mL重蒸四氢呋喃的圆底烧瓶中，再称取1.875 g氢化钠（NaH与甲巯咪唑的摩尔比为1:1.5），多次少量将NaH加入到甲巯咪唑的四氢呋喃溶液中，会发现有大量气泡产生，并且产生很多的热量，故此过程要在冰浴中进行。

再称取7.5 g溴乙酸溶解于2 mL重蒸四氢呋喃中，逐滴加入到上述圆底烧瓶中，最后加双蒸水将上述固体溶解，用浓盐酸调pH至1，加入等量的乙酸乙酯萃取，萃取3次。收集有机相，40℃减压旋蒸，最终得到红色的半抗原，收率为95%。

1.3 酶标抗原的制备

取一个25 mL的圆底烧瓶,称取0.102 g半抗原，溶解于2.76 mL DMF中，再称取0.068 g N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）加入圆底烧瓶中。然后再称取0.248 g N，N’-二环己基碳二亚胺（DCC），用最少量的二甲基亚砜（DMF）将其溶解，在氮气保护的情况下，一滴一滴向圆底烧瓶中加入DCC溶液，最后在氮气保护的情况下避光反应过夜。

24 h后离心，除去反应过程中产生的副产物1，3-二环乙基脲（DCU），取上清液。

用分析天平准确称取10.0 mg辣根过氧化酶（HRP），溶于2 mL 50 mmol/L的 K2HPO4缓冲液（pH=9.3）中。用微量移液器量取适量的上清液，缓慢滴加到上述酶溶液中，直至蛋白溶液出现轻微混浊，每滴加一次轻摇1 min左右，此过程要在冰浴中进行。将混合液放入4℃冷藏柜搅拌过夜，取出后在室温下用PBS搅拌放置1 h～2 h。

1 h～2 h以后，先将透析袋用去离子水润洗，用透析夹夹住一头儿，再将酶标抗原溶液装入透析袋中，用2 L磷酸盐缓冲液PBS溶液透析，每天换3次透析液，连续透析3 d。3 d后将透析袋取出，准确量取透析袋中酶标抗原溶液的体积，再加入等体积的甘油，放于-20℃冰箱内避光保存备用。

1.4 酶标抗原稀释度的优化

抗体是分子印迹聚合物膜，是以甲巯咪唑为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，直接在96孔酶标板上直接聚合，然后用甲醇:冰乙酸=3:1的洗脱液将模板分子甲巯咪唑超声洗脱。

将连接好的酶标抗原原液从1:500开始进行3倍梯度稀释，每孔加入100 μL酶标稀释液，室温孵育1 h。1 h后弃去酶标稀释液，用PBST洗板5次。每孔再加入150 μL底物显色液，显色30 min。30 min后每孔加入50 μL终止液。每孔吸出150 μL显色后的溶液立即在双波长方式（450 nm～650 nm）下用酶标仪读取吸光度值读数。选择对应的吸光度值在1.2～1.4之间的酶标稀释度就是后续直接竞争反应所用的酶标溶液稀释倍数。

1.5 直接竞争ELISA方法操作步骤

在直接聚合的酶标板上，每孔先加入100 μL甲巯咪唑标样溶液或样品提取液，然后立即加入100 μL酶标抗原溶液，以不加甲巯咪唑标样的孔为对照孔，室温孵育1 h，然后弃去上清液，用PBST洗液洗板5次。在每孔中加入150 μL底物显色液，室温下反应30 min。每孔加入50 μL终止液，终止反应。在双波长方式（450 nm～650 nm）下用酶标仪读取吸光度值。

1.6 ELISA标准曲线的建立

准确称取甲巯咪唑标准品配制成1000 mg/L甲醇贮备液，将其用5%甲醇-PBS稀释至60 mg/L，再依次10 倍稀释至 6000，600，60，6和 0.6 μg/L 标准溶液。按照1.5的方法得到一系列浓度标准溶液的吸光度值。

按照下式计算不同浓度甲巯咪唑对抗原抗体结合反应的抑制率值：

式中：IC%为甲巯咪唑对抗原抗体结合反应的抑制率；A对照为450 nm吸光值与650 nm吸光值的差值；A样品为甲巯咪唑标准液或样液的平均吸光度值；A空白为不加入酶标及甲巯咪唑标准液的平均吸光度值。

绘制标准曲线：以抑制率为纵坐标，甲巯咪唑浓度对数值为横坐标绘制标准曲线。每次试验均应重新绘制标准曲线。

1.7 样品的准备、添加回收试验和液相验证

称取5.00 g猪肉样品于50 mL离心管中，50、100、150 μL甲巯咪唑标准溶液（浓度为1 mg/L），黑暗放置15 min。然后加入25 mL乙腈和1 mL 4 mol/L碳酸钾溶液（除去猪肉中的蛋白质），漩涡振荡2 min，在4℃下3500 r/min离心15 min。将上清液转至分液漏斗中，残渣用同样方法再提取一次，合并上清液。分液漏斗中加入50 mL乙腈饱和的正己烷，液液萃取2 min除去脂肪，静置分层后除去正己烷相，重复萃取三次。乙腈相中加入50 mL饱和氯化钠溶液，使其乳化现象减小，液液萃取2 min后分离乙腈相，经无水硫酸钠干燥，用2 mL乙腈洗涤无水硫酸钠，合并滤液于鸡心瓶中，40℃旋转蒸干。用1 mL 5%甲醇-PBS溶液复溶，4℃保存备用。

液相色谱条件为：色谱柱采用反相Thermo C18反相柱（4.6 mm×150 mm,USA）。紫外检测器，检测波长：254 nm；直接进样量：20 μL，流速：1.0 mL/min，柱温：30℃。采用色谱峰的保留时间定性，外标法峰面积定量。流动相为:甲醇/水（10:90，v/v）。

2 结果与分析

2.1 2-S羧甲基-1甲基咪唑MS表征

2-S羧甲基-1甲基咪唑MS表征见图2。

由于接到甲巯咪唑结构上的是一个-CH2COOH，在负离子出峰，反应之前甲巯咪唑分子量是114，反应之后分子量是172，由图2可以看出在负离子出现一个比较高的171峰，即为2-S羧甲基-1-甲基咪唑的分子量减去一个H，而342是2-S羧甲基-1-甲基咪唑的分子量减去一个H的二倍体，从图2可以看出合成出的成品是纯度比较高的。

图2 2-S羧甲基-1甲基咪唑的MS图Fig.2 Mass Spectrogram of 2-S-carboxymethyl-1-methyl Iminazole

2.2 2-S羧甲基-1-甲基咪唑的1H NMR表征

2-S羧甲基-1-甲基咪唑的1H NMR表征见图3。

图3 2-S羧甲基-1甲基咪唑1H RNM表征Fig.3 1H NMR Spectrogram of 2-S-carboxymethyl-1-methyl Iminazole

氢谱以氘代乙腈为溶剂，在1H NMR图中，δ4.626～4.641（δ为化学位移，代表谱峰位置）之间是咪唑环上两个氢的共振峰。根据峰面积来看，δ4.134处是甲巯咪唑上的-CH3的共振峰。在甲巯咪唑巯基臂上后接的与-COOH相连的-CH2-在δ3.906处出现单峰，而在化学位移δ4.266是-COOH上氢质子的共振峰。

2.3 酶标稀释度的优化

对酶标稀释度优化的结果见表1。

表1 不同浓度的酶标的吸光度值Table 1 The OD of Methimazole-HRP in Different Concentration

由表1可以看出不同浓度的酶标浓度有颜色梯度的变化，证明了辣根过氧化酶-HRP成功接到了甲巯咪唑半抗原上。酶标最优稀释度为1:1500。

2.4 ELISA标准曲线

ELISA标准曲线见图4。

图4 甲巯咪唑仿生酶联免疫标准曲线Fig.4 Methimazole BELISA standard curves

从图4可以看出，以制备的分子印迹聚合物膜作为仿生抗体时，甲巯咪唑能与酶标记甲巯咪唑竞争吸附印迹膜的识别位点，产生明显地竞争效应，60 mg/L时抑制率可达到71%。在最适反应条件下，建立的直接竞争BELISA方法测定甲巯咪唑ELISA的灵敏度为100 μg/L，最低检测限为 1.1 μg/L。

2.5 实际样品的测定

为了验证所建立的BELISA方法在实际样品测定中的应用，50、100、150 μL 浓度为 1 mg/L 的甲巯咪唑标准溶液分别添加到5.00 g猪肉样品中，然后采用直接竞争BELISA方法检测，结果见表2。

表2 直接竞争ELISA与液相色谱方法对猪肉样品中添加回收甲巯咪唑的结果分析Table 2 Analysis Results of Spiked methimazole in pork samples by the developed BELISA and HPLC methods(Mean(S.D.,n=3)μg/kg

3 结论

从对合成出的产物的MS，1H NMR表征来看，证明了甲巯咪唑的-SH先与NaH或者NaOH发生反应，然后在与BrCH2COOH发生反应这一设计路线是可行的，但是利用NaOH合成出的产品需要进行柱层析纯化，而利用NaH合成出的产品纯度很高，不需要后期的纯化工作。合成出酶标抗原以后，对酶标稀释度进行了优化，酶标记抗原显色有梯度的变化，表明酶标记抗原连接成功。在仿生酶联免疫分析方法的测定中，灵敏度和最低检出限分别为（100±4）μg/L和（1.1±0.04）μg/L。在猪肉样品中，甲巯咪唑的添加回收率为77%～89%，且测定结果与HPLC具有良好的一致性。

对于甲巯咪唑在动物性食品中的残留量的检测方法有很多，但是用酶联免疫吸附测定法来检测甲巯咪唑的残留很少，本文采用的是以分子印迹技术在96-孔酶标板上直接聚合制备出仿生抗体，然后采用直接竞争方法来检测。以上酶标记抗原连接方法的合成也为用传统酶联免疫分析方法的应用奠定了基础。

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Synthesis，Application and Characterization of 2-S-carboxymethyl-1-methyl Iminazole

TANG Wei-wei,WANG Jun-ping,WANG Shuo*
(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Ministry of Education of China,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

Methimazole can promote the metabolism of protein,it had been applied illegally to animals'feed to obtain more lean meat.It has serious health implications to people.There was no report about using artificial antibody of ELISA to monitor methimazole.2-S-carboxymethyl-1-methyl iminazole was synthesized with methimazole and bromoacetic acid,it was used as hepten in Enzyme-Linked Immunosorbent Assay method.The product was characterized by MS and1H NMR.And then the Ag-HRP was synthesized.The production of 2-S-carboxymethyl-1-methyl iminazole was 73.8%-95%.The IC50and the detection limit values under optimized experimental condition were(100±4)μg/L and(1.1±0.04)μg/L,respectively.Good recoveries have ranged from 77%-89%,respectively.It had a good agreement for methimazole in comparative analysis with that using HPLC.

methimazole;bromoacetic acid;characterization;Ag-HRP;BELISA

天津自然科学基金（09JCYBJC14300）

唐伟伟（1986—），女（回），在读硕士研究生，主要研究方向：食品安全检测。

*通信作者

2011-12-22