干细胞因子SOX2调控Wnt／β－Catenin信号通路在脑胶质母细胞瘤发生中的机制研究

吴伟，李鹏，薛平

（1.成都市第一人民医院神经外科，四川 成都 610016；2.四川大学华西医院中西医结合科，四川 成都 610041）

脑胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是成人中枢神经系统最常见的原发肿瘤，由于该病具有很强的侵袭能力，生长迅速，患者死亡率及复发率较高，预后差。随着肿瘤干细胞的发现与深入研究，肿瘤干细胞理论随之产生［1］，GBM的治疗得到了有效改善。研究表明，经典Wnt信号通路参与胚胎发育的各个阶段，它的异常激活可导致肿瘤的形成。Wnt信号通路能够使β－catenin蛋白激活特定的靶基因，因此β－catenin是该传导通路的调节中心［2］。GBM是与Wnt信号系统激活密切相关的肿瘤，不同级别GBM大都伴有 Wnt信号激活［3］。SOX2作为全能型或多能性干细胞标记物，是维持干细胞未分化状态、增殖等方面的关键因子之一，在人类许多肿瘤中SOX基因均呈异常表达。本研究通过检测脑胶质母细胞瘤（GBM）组织中干细胞因子SOX2及β－Catenin蛋白的表达，探讨 SOX2及 Wnt／β－Catenin信号通路在GBM中的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

雄性SD大鼠90只，体质量（200～250）g，由武汉大学动物实验中心提供。

1.1.2 主要试剂及仪器

大鼠神经胶质瘤细胞C6购自上海丰翔生物公司；小鼠抗人SOX2多克隆抗体购自北京博奥森生物技术公司；β－catenin抗体购自上海万安生物技术有限公司；小鼠超敏二步法免疫组化试剂盒（PV－9005）购自北京欣兴唐生物科技有限公司；新生小牛血清、DMEM 培养基、D－Hanks＇液、B27添加剂、重组人表皮生长因子（EGF）、重组人碱性成纤维生长因子（FGF）、Fc段封闭抗体均购自武汉子心生物科技有限公司。桌面型数字脑立体定位仪68025购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。Gyroscan T5－NT 0.5T磁共振机由Philips医疗器械公司提供。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

将C6细胞置入含10%新生小牛血清的DMEM培养基、5%CO2，37℃饱和湿度培养箱中培养。

1.2.2 动物造模

取70只SD大鼠固定于立体定向仪上，2%戊巴比妥钠腹腔麻醉，切开头皮，暴露颅骨标志，在矢状缝右旁开3mm，前后囱中点前1mm处用牙钻钻一骨孔。静脉注射套管针抽取50μl C6细胞悬液，经骨孔垂直于颅骨外板向脑尾状核注射，最后缝合头皮，同时肌注青霉素1万U。术后3周对大鼠行磁共振扫描，筛选成瘤细胞大鼠65只。

1.2.3 GBM干细胞的分化、鉴定及原代培养

模型大鼠处死取脑部肿瘤组织，PBS反复冲洗，去除坏死组织。将肿瘤组织剪切为0.5mm组织块，制成单细胞悬液，筛网过滤，PBS冲洗离心，DMEM＋F12培养液（按1：50添加B27；EGF及FGF的终浓度为20ng／ml）重悬细胞，并调整细胞浓度至1×105个／ml后，置于培养瓶内传代培养。

1.2.4 实验分组

将剩余20只正常大鼠处死，取其脑组织按上述方法培养作为对照组，原代培养的GBM干细胞重悬于100μl培养基作为实验组。

1.2.5 免疫组化法检测SOX2及β－catenin的表达

分别取上述单细胞悬液涂片，100%冷丙酮4℃固定5min，依次加入SOX2一抗（稀释度为1：100）及β－catenin一抗（稀释度为1：1600），采用免疫组织化学SP法检测，步骤按试剂盒说明书操作。用已知的阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为空白对照，正常脑组织作为阴性对照。

1.2.6 结果判定

以细胞膜或／和胞浆出现棕黄色颗粒即定为阳性，无棕黄色颗粒为阴性。随机选择5个以上高倍视野（×400），每张切片选取具有代表性的肿瘤区域在镜下计数100个肿瘤细胞，测定阳性细胞百分率，排除坏死区和血管内皮细胞。

1.2.7 统计学方法

以SPSS 13.0软件包分析数据，组间比较采用χ2检验，采用Spearman相关分析分析目标蛋白的相关关系，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SOX2、β－catenin蛋白在 GBM 干细胞及正常脑组织中的免疫组化染色

SOX2蛋白在GBM干细胞中呈阳性表达，主要表达于细胞核，正常脑组织中未见阳性表达。βcatenin蛋白在GBM干细胞细胞核也可见大量阳性染色细胞，正常脑组织阳性染色细胞少见，见图1。

2.2 SOX2及β－catenin蛋白在GBM干细胞及正常脑组织中的表达

SOX2及β－catenin蛋白在GBM干细胞组织中的阳性表达强度分别为56.92%和43.08%，明显高于正常脑组织的0和15.0%，见表1。

表1 SOX2及β－catenin在GBM干细胞及正常脑组织中的表达

2.3 SOX2及β－catenin蛋白在肺癌干细胞表达的相关性

SOX2及β－catenin蛋白在肺癌干细胞表达的呈正相关，r＝0.372，P＜0.05。

3 讨论

随着干细胞研究的深入，多种肿瘤组织如脑胶质瘤、卵巢癌、胃癌等中的肿瘤干细胞已被成功分离鉴定，这些干细胞是脑胶质瘤的“种子”细胞，具有自我更新、增殖和多向分化潜能等干细胞属性［4］。

表2 SOX2与β－catenin蛋白表达的相关性

随着分子生物学在肿瘤发展中的应用，越来越多的基因和信号通路被证明与胶质瘤的形成有关。Wnt／β－Catenin通路是肿瘤生成过程中重要的通路之一，且与多个通路联系密切，β－Catenin是该通路中重要的转录因子，在肿瘤的生物学行为调控中起重要作用。Wnt／β－Catenin通路在各种肿瘤中呈现异常激活状态，有文献报道，恶性胶质瘤中β－Catenin的高表达影响着包括细胞增殖、侵袭、凋亡等各种恶性表型在内的生物学行为［5］。Porath等［6］通过基因芯片方法发现干细胞样基因的高表达是低分化肿瘤的分子机制。SOX2是Wnt信号通路的调控因子，作为干细胞基因，能够通过与其靶基因结合的方式调控胚胎及组织的发育，在乳腺癌、胰腺癌、肺癌等多种肿瘤组织中均有表达。

通过图1～2我们发现，SOX2及β－Catenin蛋白在GBM干细胞中均有大量阳性染色细胞，而正常脑细胞中无SOX2阳性染色细胞，也仅有少量β－Catenin阳性表达细胞。另外，表1显示，GBM干细胞中SOX2蛋白阳性表达率为56.92%，正常脑组织中未见SOX2表达，二者之间有显著差异性（χ2＝3.836，P＜0.05），提示干细胞基因SOX2在 GBM的发生过程中可能发挥了重要作用。同时，β－Catenin在GBM干细胞中阳性表达率为43.08%，显著高于正常脑组织的阳性表达率（15.0%），组间比较差异显著（χ2＝3.652，P＜0.05），提示 β－Catenin在GBM干细胞中呈高表达，也证实了当发生GBM时，Wnt／β－Catenin信号通路处于异常激活状态，与文献报道一致。从表2中我们看出，在GBM干细胞中，SOX2与β－Catenin均呈高表达，二者的表达呈正相关（χ2＝0.372，P＜0.05），由此我们推测，在肺癌GBM干细胞中，高表达的SOX2基因，通过调控 Wnt／β－Catenin信号通路使其异常激活，共同参与了GBM的发生。

综上所述，干细胞因子SOX2可能通过调控Wnt／β－Catenin信号通路，在GBM的发生发展过程中发挥重要作用，为针对GBM干细胞治疗该病提供了新靶点。

［1］Takebe N，Ivy SP.Controversies in cancer stem cells：targeting embryonic signaling pathways［J］.Clin Cancer Res，2010，16（12）：3106－3112.

［2］成夏炫，史丽云，张航，等.Wnt信号通路与肿瘤药物治疗研究进展［J］.健康研究，2011，31（6）：460－465.

［3］王海东，杜天明，项永生，等.Wnt信号调控因子Pygo2在人脑胶质瘤中的表达及意义［J］.中华神经外科疾病研究杂志，2010，9（6）：513－516.

［4］Takaishi S，Okumura T，Tu S，et al.Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44［J］.Stem Cells，2009，27（5）：1006－1020.

［5］Sanada Y，Yoshida K，Ohara M，et al.Histopathologic evaluation of stepwise progression of pancreatic carcinoma with immunohistochemical analysis of gastric epithelial transcription factor SOX2：comparison of expression patterns between invasive components and cancerous or nonneoplastic intraductal components［J］.Pancreas，2006，32（2）：164－170.

［6］赵庆生，冷飞燕，郑伟，等.干细胞因子SOX2在肺癌中的表达及意义［J］.山东医药，2011，51（28）：12－14.