3－MST mRNA在大鼠延髓的表达以及急性缺氧对其基因表达的影响

聂政，李慧，侯雪飞，周华，唐玉红，陈丽，郑煜

（四川大学华西基础医学与法医学院生理学教研室，四川 成都 610041）

硫化氢（H2S）是近年来研究较多的第3种气体信号分子，在机体内广泛参与神经［1］、心血管［2］、消化［3］等系统的生理功能调节。外源性H2S可直接由含硫化合物（如NaHS）水解而成，而内源性H2S由含硫氨基酸（如半胱氨酸）代谢生成，体内参与催化H2S生成的酶主要有3种，即胱硫醚－β－合酶（cystathionine－β－synthase，CBS），胱硫醚－γ－裂解酶（cystathionine－γ－lyase，CSE）［4，5］和3－巯基丙酮酸硫转 移 酶 （3－mercaptopyruvate sulfurtransferase，3－MST）［6，7］，CBS、CSE及3－MST 的表达具有组织特异性：CBS和3－MST主要存在于中枢神经系统［8］，CSE主要分布在神经系统以外的组织［9］，3－MST是脑内产生H2S的主要合成酶［7］。本室前期研究表明，内源性H2S参与延髓呼吸中枢节律性呼吸活动的调节并对呼吸中枢缺氧损伤具有保护作用［10，11］，然而，成年大鼠延髓是否存在3－MST、3－MST－H2S途径，是否参与急性缺氧大鼠延髓呼吸中枢缺氧损伤保护作用以及在节律性呼吸活动调节中的作用尚未见报道，因此，本实验对正常、急性缺氧以及急性缺氧加NaHS（外源性H2S供体）处理后成年大鼠延髓的3－MST mRNA表达进行了研究。1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康成年SD大鼠21只，雌雄不限，体质量为250～300g，由四川大学华西实验动物中心提供。将大鼠随机分为正常对照组（C组）、急性缺氧组（H组）和急性缺氧＋NaHS组（HN组）。

1.2 主要试剂及仪器

Trizol总 RNA 提取试剂，Invitrogen，USA；2×PCR master mix，Fermentas，USA；逆转录试剂盒，Fermentas，USA；其他试剂均为国产分析纯；PCR仪，德国Eppendorf公司；电泳仪，美国BIORad公司；立体定位仪，成都泰盟科技有限公司。

1.3 急性缺氧模型的建立和侧脑室给药

大鼠在10%乌拉坦（13mL／kg体重）腹腔给药麻醉后，行气管插管及侧脑室钻孔手术，以备侧脑室给药。侧脑室定位：前囟（bregma）后1.0mm，中线旁开1.5mm，深度为颅骨表面下4.0mm。C组动物经气管插管一端开口吸入流量为1 000mL／min的空气（气管插管的另一端开口夹闭），其侧脑室注入10μl 0.9%生理盐水，注射时间30s，H组以同样流量吸入8%O2＋92%N2低氧混合气体，持续1 h，侧脑室也注入10μl 0.9%生理盐水，注射时间30 s。而HN组侧脑室注入2.5mmol／L的NaHS 10 μl，其他处理同H组。

1.4 大鼠延髓总RNA的制备

取大鼠延髓组织，用Trizol总RNA试剂盒提取组织总RNA。将取延髓组织放于研磨钵内，加入适量液氮充分研磨，直至组织成为均匀粉末状，加入1mL Trizol液匀浆研碎组织，加0.2mL氯仿，振荡混匀，室温放置2～3min，12 000rpm离心15 min（4℃），转移水相，加0.5mL异丙醇沉淀RNA，室温放置10min，同上离心，弃上清，用75%乙醇漂洗RNA，7500rpm离心5min（4℃），干燥后用适量DEPC水溶解。用紫外分光光度计测定总RNA浓度和纯度，重复测定3次，留取OD260和OD280之比1.8～2.0的样本进行逆转录。

1.5 逆转录反应

取1μg总RNA置于70℃孵育5min后依次加入反转录缓冲液、dNTP、Randon Primer、MMuLV反转录酶，42℃反应60min后70℃加热10 min终止反应。

1.6 RT－PCR检测

采用引物设计软件primer premier 5.0设计引物，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。3－MST的上游引物为5＇－TCATCAAGACCCACGAGGATA－3＇，下游引物为5＇－CTTCTCCAGACCTTCACTGGTC－3＇内 参 βactin的上游引物为5＇－TCAGGTCATCACTATCGGCAAT－3＇，下游引物为5＇－AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA－3＇。采用生工生物工程（上海）有限公司的Revert AidTMFrist Strand cDNA Synthesis Kit，按照说明书进行PCR扩增。扩增反应体系为20μl的混合物（包括TaqDNA聚合酶、cDNA、上游及下游引物、dNTPs、MgCl2、Buffer），将所得进行3－MST及β－actin的扩增，建立25μl扩增反应体系，扩增按照35个循环进行，最后将所得产物进行琼脂糖凝胶电泳。电泳完成后，将琼脂糖凝胶板置于凝胶成像系统下观察，保存图形。用Quantity One软件测定各条带的吸光度值，用同一样本3－MST与β－actin条带吸光度值之比表示3－MST mRNA的相对表达量。

1.7 统计学处理

统计学分析数据以均数±标准差表示，用SPSS 15.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异具有显著性。

2 结果

RT－PCR结果显示，C组大鼠延髓组织扩增出3－MST mRNA 的特异性条带（图1），说明3－MST mRNA在正常成年大鼠延髓组织中有表达；H组大鼠延髓3－MST mRNA表达高于C组（图1A），差异有统计学意义（P＜0.05）（图1B）。HN组大鼠延髓3－MST mRNA表达低于H组（图1A），差异有统计学意义（P＜0.05）（图1B）。

图1 正常组、急性缺氧组和急性缺氧＋NaHS组大鼠延髓3－MST mRNA的表达

3 讨论

缺氧能引发多系统病变，若机体长时间处于缺氧状态，则会对细胞造成严重损伤。有研究表明，组织缺氧或缺血期间，其抗氧化酶活性降低，氧自由基和脂质过氧化产物增多，而未被清除的氧自由基会通过对线粒体膜的损害、呼吸链的干扰而导致细胞的损害［12］。呼吸中枢广泛分布于脊髓、延髓、脑桥和大脑皮层等整个中枢神经系统的各级部位，而基本的呼吸节律起源于延髓。延髓呼吸中枢在呼吸节律的产生及呼吸调节等活动中发挥着重要作用。

H2S被称为继NO和CO之后的第3种气体信号分子，作为新型气体信号分子的H2S，具有持续产生、快速弥散、迅速传播等特点，在多系统的重要生理和病理过程中发挥着重要的调节作用［1，2］。H2S一般以结合型硫烷硫（bound sulfane sulfur）的形式储存在神经元和星型胶质细胞内，当细胞兴奋时，结合型硫烷硫释放出H2S，与CBS相比，3－MST能更有效地催化生成结合型硫烷硫，因此，有研究者提出3－MST是重要的合成内源性H2S的酶，而且是脑内H2S的主要合成酶［7］。目前关于3－MST是否存在于延髓、3－MST－H2S途径是否参与节律性呼吸活动的调节以及在急性缺氧条件下是否会参与由急性缺氧引起的呼吸反应和呼吸中枢的保护效应尚未见报道。已有研究表明，内源性H2S不仅参与对心血管系统的调节［2］、内分泌系统的调节［13，14］及呼吸系统功能活动的调节［10］，研究还发现H2S在鳟鱼腮化学感受器中参与对缺氧的感受活动［15］，除此以外它还参与平滑肌细胞对缺氧的舒缩反应［16］。本室前期在新生大鼠离体延髓脑片灌流实验中发现，由CBS催化产生内源性H2S参与了节律性呼吸活动的中枢性调节，而这一作用可能是通过激活KATP通道和cAMP信号通路实现的［10］，给予外源性H2S可减轻缺氧对延髓脑片呼吸中枢造成的损伤，表明H2S对延髓呼吸中枢缺氧损伤具有保护作用［11］，过量表达的CBS可以减轻缺氧诱导的细胞凋亡［17］。

既然由CBS催化产生的内源性H2S参与了节律性呼吸活动的中枢性调节，那么主要分布于神经元且催化效率较高的H2S合成酶3－MST是否存在于大鼠延髓？3MST－H2S途径是否参与节律性呼吸的中枢性调节？该途径是否参与急性缺氧大鼠延髓呼吸中枢缺氧损伤保护作用？为此，我们采用RTPCR方法，首先在基因转录水平，观察了3－MST mRNA在正常大鼠、急性缺氧大鼠和急性缺氧＋NaHS大鼠延髓的表达情况。结果显示，在正常大鼠延髓，扩增出3－MST基因特异条带，说明延髓存在产生内源性H2S的另一个关键酶3－MST。该结果提示，3－MST－H2S途径可能参与节律性呼吸的中枢性调节；与正常组相比，急性缺氧组大鼠延髓3－MST mRNA的表达明显增加，提示急性缺氧可以上调3－MST mRNA的表达。该表达上调可能通过后续催化内源性H2S生成，从而对急性呼吸中枢缺氧损伤起到保护作用；而侧脑室注射外源性H2S供体NaHS后大鼠延髓3－MST mRNA的表达明显低于急性缺氧组，由于H2S一般以结合型硫烷硫的形式存在，当细胞兴奋时，结合型硫烷硫释放出H2S。当加入外源性H2S后，组织中升高的H2S浓度可能反过来抑制体内结合型硫烷硫释放出H2S，导致内源性H2S生成减少，3－MST mRNA的表达因而减少，这也提示3－MST－H2S途径可能参与急性缺氧大鼠延髓呼吸中枢缺氧损伤保护作用及节律性呼吸的中枢性调节作用。

4 结论

正常大鼠延髓组织存在产生H2S的另一个关键酶3－MST，急性缺氧能上调大鼠延髓3－MST mRNA的表达，外源性H2S能抑制急性缺氧大鼠3－MST mRNA的表达。

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