葵花籽仁粕乙醇提取物抗氧化性的研究

赵涛，高聚林，董义珍，包志华，其木格，王勇

（1.内蒙古农业大学，内蒙古 呼和浩特 010010；2.内蒙古商贸职业学院，内蒙古 呼和浩特 010070）

葵花籽仁粕乙醇提取物抗氧化性的研究

赵涛1，2，高聚林1，*，董义珍2，包志华2，其木格2，王勇2

（1.内蒙古农业大学，内蒙古 呼和浩特 010010；2.内蒙古商贸职业学院，内蒙古 呼和浩特 010070）

以油葵、食葵的葵花籽仁除油后乙醇提取物为研究对象，在测定其提取物中总酚酸含量的基础上，用K3［Fe（CN）6］测定了它们的还原力；采用D－脱氧核糖－铁体系、超氧阴离子自由基体系、二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）体系进行抗氧化活性的研究，并同Vc进行了比较。结果表明：油葵、食葵的葵花籽仁粕乙醇提取物均有显著的抗氧化性，呈剂量效应关系，其中葵花籽仁粕乙醇提取物的抗氧化活性与其总酚含量密切相关。当葵花籽仁粕多酚浓度为0.05 mg/mL时，对DPPH·的清除率都超过了95%；当多酚浓度为0.2 mg/mL时，对超氧阴离子自由基的清除率，油葵、食葵分别为57.83%、45.24%；对·OH的清除率，油葵、食葵分别达到77.61%、68%；在实验浓度范围内0.005 mg/mL～0.2 mg/mL，葵花籽粕乙醇提取物的抗氧化性高于VC。

葵花籽；乙醇提取物；抗氧化性

向日葵（Helianthus annuus L.）是菊科（Compositae）向日葵属（Helianthus）的一年生植物。原产于北美洲南部、西部以及秘鲁和墨西哥北部的干旱地区。一般可分为油用型（oil－type sunflower） 和食用型（edible－type Sunflower）2种类型，我国已有18个省市（自治区）种植向日葵，产区主要分布在东北、华北和西北半干旱、轻盐碱地区，其中内蒙古栽培面积最大[1]。

无论是油葵还是食葵，均具有较高的营养价值。除了含有脂肪、蛋白质、维生素和微量元素外，还含有甾醇、皂甙、胆碱、木脂素和酚类化合物。这些化合物是葵花籽发挥抗氧化作用的主要物质。王放银等研究证明葵花籽壳绿原酸提取液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌均有明显的抑菌作用[2]。陈少洲等的研究结果表明，向日葵籽酚酸中的绿原酸（CGA）、咖啡酸（CA）可以抑制低密度脂蛋白（LDL）发生过氧化反应，减少过氧化脂质的生成，从而阻止氧化低密度脂蛋白（oxLDL）对内皮细胞的损伤[3]。

酚类化合物是一族具有生物活性的物质，广泛存在于植物中，其本身的酚羟基结构极易与自由基反应，提供质子和电子使其失去反应活性，故具有显著的抗氧化特性。研究发现，多酚类化合物具有延缓肿瘤的发作、抑制肿瘤的形成、抑制低密度脂蛋白氧化及抑制血小板凝集等功能，这些功能都与其抗氧化性能有关。向日葵是酚类含量较高的植物，其中绿原酸和咖啡酸的含量最高。国内长期以来对向日葵的研究主要集中在提取物和它的一些单独成分的研究上，而对某些重要成分在总的提取物里面所起的作用没有做过相关的研究。本实验用一些典型的体外抗氧化体系，分析向日葵籽仁乙醇提取物与等量抗坏血酸的抗氧化能力差异，揭示其抗氧化作用与其含量的内在关系及其抗氧化作用的物质基础，为进行向日葵籽类的开发提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料

食葵：RH118；油葵：巴葵杂4号；葵花籽仁粕乙醇提取物：内蒙古农业大学农业信息实验室自制，原料来自内蒙古包头市土右旗境内的内蒙古农业大学职业技术学院生产基地。

1.2 试剂

脱氧核糖、抗坏血酸（VC）、DPPH·、磷酸二氢钾、氢氧化钾、EDTA、三氯化铁、过氧化氢、磷酸二氢钠、盐酸、硫代巴比妥酸（TBA）、磷酸氢二钠、铁氰化钾、三氯乙酸、邻苯三酚、氯化钠、硫酸亚铁等均为分析纯。

1.3 主要仪器

PHS-3C pH计：上海雷磁仪器厂；电子天平：德国Sartorius公司；SHB-III型循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；T6新世纪紫外可见光分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；FD-1冷冻干燥机：北京德天佑科技发展有限公司；HH-4恒温水浴锅：国华电器有限公司；RE52-99旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂等。

1.4 方法

1.4.1 葵花籽仁粕乙醇提取物的制备方法

将葵花籽仁粉碎去油后过80目筛，用75%乙醇提取，料液比1∶13（g∶mL），40 ℃提取3次，然后于45 ℃减压旋转蒸发，浓缩液于10000r/min、1℃～4℃离心30min，收集上清液，冷冻干燥后得样品葵花籽仁粕乙醇提取物。

1.4.2 葵花籽仁乙醇提取物酚酸含量的测定方法

酚酸含量的测定采用Foiln－Ciocalteμ法（用原儿茶酸作标准物）[4]。准确移取一定浓度的各待测样品提取液100 μL，分别加入Folin酚试剂1 mL，10%Na2CO3溶液5 mL，然后用纯净水定容至10 mL，混合均匀，常温下避光暗反应1 h，于760 nm波长下测定吸光值。葵花籽仁粕乙醇提取物中的酚酸含量表示为相当于原儿茶酸的质量。

1.4.3 还原能力的测定

方法[5]，并略作改进。取2.5 mL的不同样品（空白用1mL蒸馏水代替，其他试剂依次同下）溶液，加入2.5 mL的磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH＝6.6）及1%的K3Fe（CN）6溶液2.5 mL，于50 ℃水浴反应20 min后急速冷却，加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，取反应液5 mL，加入5 mL的H2O和0.1%的FeCl3溶液1 mL，混合均匀，10 min后于700 nm处测定其吸光度值，以水为空白。以下实验均以抗坏血酸作阳性对照。浓度设计：0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 mg/mL（样品浓度指加入反应体系前样品的浓度，以下同）。

1.4.4 对羟基自由基的清除作用

采用D-脱氧核糖-铁体系法[6-7]。在洁净干燥的试管中依次加入0.4 mL 50 mmol/L的KH2PO4-KOH缓冲液，一定浓度的样品，0.1 mL 1.04 mmol/L的EDTA溶液，0.1 mL 20 mmol/L的FeCl3溶液，0.1 mL10 mmol/L的H2O2，0.1 mL 60 mmol/L的DR （其中对照不加），0.1 mL 20 mmol/L的VC，保证每管最终体积为1 mL，于37℃下保温1 h，取出迅速加入25%的盐酸1 mL终止反应，加1 mL 1%的TBA，于沸水浴上煮沸15 min，立即冷却，若有混浊加入3 mL正丁醇萃取，于532 nm下比色，测吸光度。清除率按以下公式计算：

式中：A0为空白吸光度；A1为加入清除剂和DR后吸光度；A2为样品本身吸光度（不加DR）。

1.4.5 对超氧阴离子的清除作用

参照邻苯三酚自氧化法[8]。取0.2 mL不同浓度的样品稀释液，加入4.6 mL 0.1mol/L Tris-HCl（pH 8.2）振荡混匀，25℃水浴10 min加入0.1 mL 3 mmol/L邻苯三酚（25℃预热）。迅速混匀并开始计时，325 nm测定吸光度，每隔30 s读取A325，4 min后结束。空白对照组以0.2 mL蒸馏水代替样品，作吸光度随时间变化的回归方程，其斜率为V对照，清除率按以下公式计算：

式中：V对照为邻苯三酚的自氧化速率；V样品为加入样品后邻苯三酚的氧化速率。

1.4.6 对DPPH自由基的清除作用

二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）是一种很稳定的自由基，在乙醇溶液中呈深紫色，在517 nm处有最大吸收峰，当有自由基清除剂存在时其颜色减退，褪色程度与清除剂的清除能力及数量呈定量关系。因此，可用分光光度法进行定量分析，从而评价抗氧化物质的抗氧化能力[9-10]。

将2 mL溶剂与2 mL 20 mmol/L DPPH·溶液加入同一试管中，摇匀，放置30 min，用溶剂作参比测定其吸光度（即A空），测定样品清除能力时，所取试剂同前，只是分别加2 mL样液代替2 mL溶剂，静止30 min后测A值（用同浓度样液作为参比）即为待测管光吸收值（即A样）。清除率按以下公式计算：

2 结果与分析

2.1 不同品种葵花籽仁粕乙醇提取物中的总酚酸含量

酚类化合物是广泛存在于水果、蔬菜和谷类食物中的植物次生代谢产物，有多种生物活性，尤其在预防心脑血管、癌症以及衰老方面发挥着十分重要的作用。同其它的果实相比，向日葵籽仁中含有较多的酚酸类物质，其中约70%是绿原酸[11]，咖啡酸的含量也较高。本文采用Folin-Ciocalteu法测定主产于内蒙古地区2个向日葵品种乙醇提取物中的总酚酸含量，结果见表1。

表 1 葵花籽仁粕乙醇提取物的总酚含量aTable 1 Total phenolic contents of sunflower seed ethanol extractsa

从表1可知，2种葵花籽仁粕乙醇提取物中总酚酸含量存在一定差异，其中油葵乙醇提取物总酚酸含量较食葵高，每克提取物中含有（26.36±3.27）mg总酚酸。

2.2 葵花籽仁粕乙醇提取物还原能力

还原力是表示抗氧化物质提供电子能力的重要指标，抗氧化剂通过自身的还原作用给出电子而使自由基变为稳定的分子，从而失去活性[12]。由图1可以看出，葵花籽仁粕乙醇提取物在低浓度下，A700值比较小，说明低浓度下还原能力比较差；但当浓度大于0.01mg/mL时，随着浓度的增大，A700值也增大，还原能力增加幅度较大。即在反应体系中，葵花籽仁粕乙醇提取物加入的量越多，吸光值越大，还原力越强。在相同浓度下，油葵的还原力最强，并且葵花籽仁粕乙醇提取物的还原力显著高于VC。相关分析表明，不同剂量下葵花籽仁粕乙醇提取物的还原力与其总酚含量存在正相关，表明葵花籽仁粕乙醇提取物的还原力与其总酚含量有关，即提取物中总酚含量越高，还原能力也越高。这也是油葵提取物还原力高于食葵的主要原因。

2.3 葵花籽仁粕乙醇提取物对羟基自由基的清除能力

羟自由基是目前所知活性氧中对生物体毒性最强，危害最大的一种自由基[13]。它可以与生物体内的多种分子作用，造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等物质氧化性的损伤，使细胞坏死或突变[14]。羟自由基清除率是反映物质抗氧化作用的重要指标[15]。葵花籽仁粕乙醇提取物中酚类化合物能够提供电子和质子氢，与羟基自由基反应，尤其是葵花籽仁粕乙醇提取物中的绿原酸，分子中含有一定量的R-OH基，能形成具有抗氧化作用的氢自由基，可以消除羟基自由基的活性，保护组织免受氧化作用的损害，提取物对羟基自由基的清除能力见图2。

由图2可以看出，在实验浓度范围内（0.005mg/mL～0.2 mg/mL），VC和葵花籽仁粕乙醇提取物对脱氧核糖－铁体系产生的·OH均表现出一定的抑制作用，并随着浓度的增加，清除率增大。VC和葵花籽仁粕乙醇提取物在低浓度下清除率有上升的情况，即在浓度小于0.05 mg/mL时，清除率随浓度的增加上升缓慢，而在浓度高于0.05 mg/mL时，产生明显而且稳定的清除作用。在实验的浓度范围内油葵、食葵清除率可达77.61%、68%，它们与VC对羟基自由基的清除作用趋势一致。

2.4 葵花籽仁粕乙醇提取物对超氧阴离子的清除能力

葵花籽仁粕乙醇提取物对超氧阴离子的清除能力，见图3。

如图3所示，在浓度低于0.02 mg/mL时，VC、葵花籽仁粕乙醇提取物对邻苯三酚自氧化体系产生的O2-·没有清除能力，在浓度高于0.02 mg/mL时，VC、葵花籽仁粕提取物对邻苯三酚自氧化体系产生的O2-·有一定的清除作用，且随加入量的增加，清除率上升，量效关系明显。在浓度高于0.1 mg/mL时，清除率呈直线上升趋势。在0.2 mg/mL时，油葵和食葵的最大清除超氧阴离子可达57.83%和45.24%，说明高浓度的VC和葵花籽仁粕乙醇提取物对超氧阴离子有很强的清除作用。

2.5 葵花籽仁乙醇提取物对DPPH·的清除作用

DPPH·是一种稳定的自由基，其醇溶液呈深紫色，在517 nm处有一吸收峰。当反应系统中存在自由基清除剂时，它可以和DPPH·的单电子配对而使517 nm处的吸收峰渐渐消退。根据消退速度和峰值改变程度可了解反应系统中自由基清除剂的反应速度和能力[16-17]。用DPPH·筛选自由基清除剂具有简便、快速、灵敏和直接可行的优点[18]，因此目前国内外用DPPH·法测定抗氧化能力。通过研究葵花籽仁粕乙醇提取物和VC对DPPH·溶液清除率的大小，以确定葵花籽仁粕乙醇提取物抗氧化性的大小。清除率越大，抗氧化性越大，提取物对DPPH·的清除作用见图4。

从图4可以看出，VC、葵花籽仁粕乙醇提取物对DPPH·的清除作用随浓度升高逐渐增强，在0.2 mg/mL时，清除率约100%，基本将DPPH·清除完全，而且葵花籽提取物的清除作用与VC接近。由此可以看出，葵花籽仁粕乙醇提取物对DPPH·有很强的清除能力，说明葵花籽仁粕乙醇提取物是良好的质子供体，并有可能反应生成更稳定的物质，可作为抗氧化剂。

3 结论

不同品种葵花籽仁粕乙醇提取物中总酚酸含量存在差异，油葵籽仁粕乙醇提取物中的总酚酸含量高于食葵。葵花籽仁粕乙醇提取物的还原力与其总酚酸含量有关，即提取物中总酚酸含量越高，还原能力也越大。

葵花籽仁粕乙醇提取物中具有明显的抗氧化能力，抗氧化能力与其中酚酸物质的含量有相关性。酚酸含量高的油葵籽仁粕乙醇提取物对抑制·OH、清除超氧阴离子和DPPH·的能力高于食葵，并且葵花籽仁粕乙醇提取物的抗氧化性高于VC。以上研究表明葵花籽仁粕乙醇提取物有较强的抗氧化活性，从化学本质上证实了葵花籽仁粕乙醇提取物的抗氧化能力，为进行葵花籽仁粕乙醇提取物的生物活性或相关保健品的研究提供理论基础，为以后的深入研究提供了参考。

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Study on Antioxidant Effects of Sunflower Seed Extract from Ethanol

ZHAO Tao1，2，GAO Ju－lin1，*，DONG Yi－zhen2，BAO Zhi－hua2，QI Mu－ge2，WANG Yong2
（1.Inner Mongolia Agriculture University，Hohhot 010010，Inner Mongolia，China；2.Inner Mongolia trade Vocational College，Hohhot 010070，Inner Mongolia，China）

Ethanol extracts of the oil－sunflower seed and edible－sunflower seed meal was studied，the determination of total in the extract phenolic acids content，Comparing with VC，the antioxidation activity was studied by D－deoxyribose－iron system，superoxide anion radical system，and DPPH·system，with K3[Fe（CN）6]evaluating their capacity deoxidizing.The results demonstrated that all tested sunflower seed meal ethanol extracts showed very good antioxidant activity with dose－effect dependent，and the positive correlation among the content of total phenolics.Results of the antioxidation indicated that the rate of scavenging DPPH was over 95%when concentration of polyphenols was 0.05 mg/mL；the inhibitory rate of the oil－sunflower and ediblesunflower to O2－·was 57.83%，45.24%and to·OH was 77.61%，68%when concentration of polyphenols was 0.2 mg/mL；in the concentration range 0.005 mg/mL-0.2 mg/mL，sunflower seeds meal ethanol extracts oxidation stability than VC.

sunflower seed；ethanol extracts；anti－oxidation

赵涛（1974—），女（汉），讲师，在读博士研究生，主要从事农产品加工。

*通信作者：高聚林，教授，主要从事作物生理生态及决策系统的研究。

2011-07-26