降胆固醇合生元组合的体外筛选

秦翠丽，刘文静，王德舜，胡随随，张永柱，朱宇博，丁广歌

（河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471003）

动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病目前已成为威胁人类健康的第一大杀手。WHO认为引发心脑血管疾病的主要原因之一就是高血脂症[1]。临床实践表明，降低血清胆固醇浓度能够显著降低心脑血管病的死亡率[2]。因此，筛选降低血清中胆固醇水平的有效制剂，是当前科研人员研究的热点。

益生菌是一类能够对人体健康起到促进作用的活体微生物。迄今为止，已发现其具有多种生物活性，降低血清胆固醇水平是其重要的生理活性之一[3-8]。益生元是可选择性刺激益生菌生长并能对宿主产生健康效应的物质，在降低血脂和胆固醇方面也有一定功效[9]。而益生菌和益生元组成的新一代微生态调节剂——合生元，目前已成为益生菌保健应用新的研究热点。

国外资料表明，在降低血清胆固醇水平方面，使用合生元比单独使用益生菌或益生元效果要好，能显著降低血清胆固醇水平[10-12]。但目前国内有关合生元组合降胆固醇的研究报道还很少。因此，筛选并优化出具有降胆固醇功能的合生元组合，对于降低心脑血管病的发生具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

婴儿双歧杆菌、保加利亚乳杆菌：由河南科技大学食品与生物工程学院微生物实验室分离鉴定。

1.1.2 培养基

PTYG：胰蛋白胨0.5%，酵母粉1.0%，葡萄糖1.0%，吐温800.1%，大豆蛋白胨0.5%，无机盐溶液4%，L-半胱氨酸盐酸盐0.05%（培养基煮沸后加入），pH7.0，琼脂1.5%～2.0%以上，培养基（液体）在接种前煮沸驱氧后接种，于厌氧箱中培养。

无机盐溶液（1 L）：CaCl2（无水）0.2 g，MgSO4·7H2O 0.48 g，K2HPO41.0 g，KH2PO 41.0 g，NaCl 2.0g，NaHCO310.0 g，混合CaCl2和MgSO4在300 mL蒸馏水中直至溶解，加500 mL蒸馏水，边搅拌边缓慢加入其他盐类，继续搅拌直至全部溶解，加200 mL蒸馏水混匀，保存到4℃下备用。

PTYG-胆固醇培养基：大豆蛋白胨0.5%、酵母浸粉1.0%、益生元1.0%、胰蛋白胨0.5%、吐温800.1%、L-半胱氨酸盐酸盐0.05%、无机盐溶液4.0%、猪胆盐0.3%、胆固醇终浓度为0.2m g/mL，pH7.0。

1.1.3 益生元

水苏糖：中国食品发酵工业研究院；低聚异麦芽糖、低聚果糖：山东保龄宝生物技术有限公司；山梨醇：天津市科密欧化学试剂开发中心；水解酪蛋白、胆固醇：上海蓝秀科技发展有限公司。

1.1.4 仪器

miniMACS厌氧培养箱：英国DWS；紫外可见分光光度计（WFZ，UV2800AH型）：尤尼柯（上海）仪器有限公司；TG16-W微量高速台式离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化

将婴儿双歧杆菌、保加利亚乳杆菌分别接种于PTYG液体培养基，连续活化3次，每次厌氧培养24 h，使菌液终浓度为8×109CFU/mL和7.2×108CFU/mL。

1.2.2 单一益生元与单一益生菌降胆固醇合生元的组合筛选

将活化的婴儿双歧杆菌、保加利亚乳杆菌分别按体积分数为2%的接种量分别接种到含有1%单一益生元——低聚异麦芽糖、酪蛋白、水苏糖和山梨醇或葡萄糖的20 mL PTYG-胆固醇培养基中，37℃厌氧培养72 h后测定发酵液中胆固醇水平。以不添加益生元及葡萄糖、接种有等量益生菌的PTYG-胆固醇培养基作对照。

1.2.3 保加利亚乳酸菌与混合益生元合生元组合降胆固醇的筛选

将活化的保加利亚乳杆菌按体积分数为2%的接种量分别接种到含有1%混合益生元（质量比1∶1）——低聚异麦芽糖+葡萄糖、低聚果糖+葡萄糖、低聚异麦芽糖+低聚果糖的20 mL PTYG-胆固醇培养基中，37℃厌氧培养72 h后测定发酵液中胆固醇水平。以不添加益生元及葡萄糖、接种有等量同种益生菌的PTYG-胆固醇培养基作对照。

1.2.4 婴儿双歧杆菌与混合益生元合生元组合降胆固醇的筛选

将活化的婴儿双歧杆菌分别按体积分数为2%的接种量分别接种到含有1%混合益生元（质量比1∶1）——低聚异麦芽糖+葡萄糖、低低聚异麦芽糖+酪蛋白、低聚异麦芽糖+葡萄糖、山梨醇+酪蛋白、山梨醇+葡萄糖、酪蛋白+葡萄糖的20 mLO PTYG-胆固醇培养基中，37℃厌氧培养72 h后测定发酵液中胆固醇水平。以不添加益生元及葡萄糖、接种有等量同种益生菌的PTYG-胆固醇培养基作对照。

1.2.5 胆固醇含量测定

采用硫酸铁铵显色法测定胆固醇含量[13]。精确量取各个三角瓶的细菌发酵液0.1 mL，分别放入干燥洁净的5 mL离心管中，再分别加入4.9 mL无水乙醇，混匀后进行4000 r/min离心15 min；分别取各离心管上清液3.0 mL放入干燥洁净试管，再沿试管壁缓慢加入3.0 mL硫酸铁铵显色液，振荡混匀，待冷却至室温，测定其在560 nm处的吸光度。根据下列公式计算胆固醇去除率：

1.2.6 统计分析

数据以OD560±SD表示，并用SPSS软件对数据进行方差分析和差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 单一益生元与单一益生菌降胆固醇合生元的组合筛选

单一益生元与单一益生菌合生元组合体外降胆固醇效果见表1。

表1数据说明：对于保加利亚乳杆菌，在添加葡萄糖、低聚异麦芽糖、酪蛋白、水苏糖和山梨醇单一益生元时，发酵液胆固醇的去除率均高于对照组，分别为30.6%、26.6%、28.8%、7.9%、43.2%，去除率在7.9%～43.2%之间，其中保加利亚乳杆菌+山梨醇合生元组合去除胆固醇效果最为明显，去除率高达43.2%，该组合基质中胆固醇水平显著低于对照组（P<0.05）；而婴儿双歧杆菌与上述益生元组合去除率分别为25.0%、8.1%、18.3%、12.0%、20.8%，去除率在8.1%～25.0%之间，总体低于保加利亚乳杆菌。这一研究结果与于景华[14]等发现7株益生菌在纯培养模型和发酵模型中均表现出不同的脱除胆固醇能力相吻合。

表1 单一益生元与单一益生菌合生元组合体外降胆固醇效果（OD560±SD）Table 1 Effect of single probiotic and prebiotic combination on cholesterol contents in vitro

实验组合生元组合的去除胆盐能力高于对照组，且同一益生元与不同菌株构成的合生元组合会表现出的不同降胆固醇作用，与益生元的促生长作用、相互间的协同作用以及不同合生元组合中菌株所产生的胆盐水解酶的量与活性、细菌细胞壁吸附胆固醇、细菌细胞膜吸收胆固醇、细菌细胞质积累胆固醇的能力不同有关[15]。

但值得注意的是，并非所有益生元都能提高益生菌的去除胆固醇能力，在添加低聚果糖作为益生元时，保加利亚乳酸杆菌与婴儿双歧杆菌的胆固醇的去除率均为负值，即培养基中的胆固醇水平比试验前还要高，这种结果出现的原因待进一步研究。

2.2 保加利亚乳杆菌与混合益生元降胆固醇合生元组合的筛选

保加利亚乳杆菌与混合益生元降胆固醇合生元组合体外试验效果见表2。

表2 混合益生元与保加利亚乳杆菌合生元组合体外降胆固醇效果(OD560±SD)Table 2 Effect of Bulgaria lactobacillus and mixed prebiotics combination on cholesterol contents in vitro

表2数据说明：在低聚异麦芽糖+葡萄糖混合益生元存在时，合生元组合去除胆固醇的能力高于对照组，但不显著（P>0.05），仅为1.6%，比单独添加聚异麦芽糖或葡萄糖的去除胆固醇能力都要弱许多；但在低聚异麦芽糖+低聚果糖、低聚果糖+葡萄糖混合益生元存在时，合生元组合不仅没有去除胆固醇，能力反而低于对照组，且与对照组相比差异显著（P<0.05）。这种情况的出现推测其原因是不同益生元同时存在时，相互之间出现干扰或抑制现象造成的。

2.3 婴儿双歧杆菌与混合益生元降胆固醇合生元组合的筛选

婴儿双歧杆菌与混合益生元合生元降胆固醇组合体外试验效果见表3。

表3 混合益生元与婴儿双歧杆菌合生元组合体外降胆固醇效果(OD560±SD)Table 3 Effect of B.infantis and mixed prebiotics combination on cholesterol contents in vitro

表3数据说明：山梨醇+酪蛋白混合益生元与婴儿双歧杆菌降胆固醇合生元组合的去除胆固醇效果最好，去除率为27.0%，与对照组相比差异显著（P<0.05），且比任何单一益生元组合的去除率都高，这种情况的出现可能是山梨醇与酪蛋白不是同一类物质的益生元，彼此之间的不会出现干扰或抑制现象，且与益生菌间有良好的协同作用、促进胆盐的水解酶的分泌或增强细菌对胆盐的吸收与积累。

在低聚异麦芽糖+山梨醇、山梨醇+葡萄糖、酪蛋白+葡萄糖混合益生元存在时，合生元组合的去除胆固醇的能力略高于对照组，去除率分别为2.1%、7.4%、3.7%，比单独添加低聚异麦芽糖、山梨醇、酪蛋白或葡萄糖时的去除胆固醇能力要低许多；而在低聚异麦芽糖+酪蛋白、低聚异麦芽糖+葡萄糖混合益生元存在时，合生元组合去除胆固醇的能力反低于对照组，这些情况的出现，可能原因同2.2。

3 结论

本实验结果表明，保加利亚乳杆菌和婴儿双歧杆菌合生元组合的降低胆固醇效果与益生菌、益生元种类和搭配有关。保加利亚乳杆菌降低胆固醇效果总体好于婴儿双歧杆菌，说明与菌株特异性有关[16]。在山梨醇存在条件下，保加利亚乳杆菌对胆固醇的去除率达到43.2%，效果显著（P<0.05）；当培养基中添加山梨醇+酪蛋白时，婴儿双歧杆菌对胆固醇的去除效果最好，去除率为 27.0%，效果显著（P<0.05）。V.Mandal等[17]报道称以P.acidilactici LAB 5+山梨醇喂食瑞士白化病老鼠可以显著降低其血浆胆固醇水平，说明山梨醇对乳酸菌降胆固醇作用明显。因此可以将保加利亚乳杆菌+山梨醇组合作进一步优化。

本研究还发现：凡添加低聚果糖的培养基，胆固醇水平均高于对照组，这与Liong等[18]体内研究结果相反；益生元单独添加和混合添加作用效果明显不同，甚至出现相反的结果。这些均表明益生元对益生菌降胆固醇的作用复杂，详细机制仍有待研究。

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