两种大肠杆菌显色培养基检测效果的比较

张淑红，郑扬云，吴清平，徐晓可，张菊梅，郭伟鹏

（广东省华南应用微生物重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东省微生物应用新技术公共实验室，广东省微生物研究所，广东 广州 510070）

大肠杆菌（Escherichia coli）是人和动物肠道的正常菌群，当机体抵抗力下降或其侵入肠外组织或器官时，可作为条件致病菌引起肠道外感染，是国际上公认的卫生监测指示菌，食物或水中大肠杆菌的检出即意味着直接或间接的近期粪便污染。

在国内外各种标准检验方法中，食品中大肠杆菌的分离通常采用麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂（EMB），并结合其他生化反应如乳糖发酵情况、氧化酶试验、三糖铁琼脂（TSI）、靛基质试验、尿素酶试验、糖发酵等进行鉴定，检测周期较长。

近年来，一些显色培养基被逐步研发出来，用于大肠杆菌的快速分离和鉴定。与传统分离培养基相比，显色培养基省去了对菌株进行纯培养的步骤，直接根据菌落颜色就可以做出初步判断，具有更高的敏感性和特异性，操作简便快速，可大大节省人力和物力[1-3]。

广东环凯HKM和法国科玛嘉CHROMagar E是国内外检测机构和食品企业应用较多的两种大肠杆菌显色培养基，为进一步探讨显色培养基的应用价值，本研究随机采集了广州市区超市和集贸市场的100份食品样品，通过分析食品中大肠杆菌的污染情况，比较了HKM和CHROMagar E显色培养基的应用效果，为显色培养基的开发和技术改进提供基础研究资料参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本来源

100份食品分别采自广州市区的超市和农贸市场，包括肉制品19份（包括生鲜和冷冻猪肉、牛肉、鸡肉、鸭肉、腊肉等）、速冻食品12份（饺子、云吞）、乳制品14份（巴氏杀菌乳、高温杀菌乳、豆奶等）水产品16份（鱼、虾、贝类）、果蔬16份、熟食19份（凉拌菜、粉面和熟肉制品等）、食用菌4份。

1.1.2 主要仪器设备

移液器100-1000 μL：北京吉尔森科技有限公司；生物安全柜AC2-4S1：广州浩瀚仪器有限公司；全自动高压灭菌锅TOMYES-215：日本三洋公司；一次性接种环1 μL：恒温培养箱DNP-9082、恒温水浴锅DK80：广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.3 培养基和试剂

CHROMagar E大肠杆菌显色平板：由郑州博赛生物技术研究所分装；乳糖胆盐发酵培养基、HKM大肠杆菌显色培养基：广东环凯微生物科技有限公司生产；API 20E生化鉴定试剂条：法国生物梅里埃公司生产。以上培养基和试剂均在有效期内使用。

1.2 检验方法

检测方法参考GB/T4789.6-2003《食品卫生微生物学检验-致泻大肠埃希氏菌检验》[4]，具体方法如下。

1.2.1 样品处理

无菌条件下将样品在彻底剪碎，混匀，以无菌操作取样品25 g（mL）加入到含有225 mL灭菌生理盐水的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1min～2 min。

1.2.2 分离

参考大肠菌群MPN计数的检验程序对大肠杆菌进行MPN计数[5]，按9管法将样品处理液接种乳糖胆盐发酵管，（36±1）℃培养24 h后，取产酸产气的乳糖发酵管中的菌液划线接种于HKM和CHROMagar E显色培养基，于（36±1）℃培养 18 h～24 h，观察各个平板上生长的菌落。每个平板上挑取2个～3个疑似菌落，划线接种NA平板纯化，（37±1）℃培养18 h，进行鉴定。

1.2.3 鉴定

挑取纯培养可疑菌落，进行染色镜检和氧化酶试验，同时利用API 20E鉴定条进行生化鉴定。

1.2.4 统计方法

运用SPASS13.0软件对数据进行统计分析，采用卡方检验比较两种大肠杆菌培养基阳性率的差异。

2 结果与分析

2.1 两种培养基大肠杆菌生长状况

将样品增菌液划线接种显色培养基18 h～24 h后，可以直接观察到蓝绿色菌落生长，如图1所示。

图1 两种显色平板上大肠杆菌生长情况Fig.1 The performance of E.coli on two chromogenic media

在HKM大肠杆菌显色平板上，可疑大肠杆菌为圆形、光滑、边缘整齐、直径1 mm～2 mm的深蓝色或蓝色，在CHROM agar E大肠杆菌显色平板上，可疑大肠杆菌呈现圆形、光滑、边缘整齐、直径1 mm～2 mm的蓝色或绿色菌落，色泽均较HKM显色平板稍浅。检验过程中发现，在杂菌抑制方面，CHROMagar E显色培养基略好于HKM显色培养基。

2.2 两种培养基大肠杆菌检出率比较

两种培养基大肠杆菌检出率结果见表1。

表1 两种显色培养基上大肠杆菌的检出情况Table 1 The positive rate of E.coli on the two chromogenic media

本次试验共检测蔬菜水果16份，HKM显色培养基检出大肠杆菌7份，阳性率43.8%，CHROMagar E显色培养基检出大肠杆菌6份，阳性率为37.5%，卡方检验表明，两者无显著性差异（X2=0.13，P=0.719>0.05）；检测肉制品19份，HKM显色培养基检出大肠杆菌17份，CHROMagar E显色培养基检出大肠杆菌17份，两者阳性率吻合，无差异；其余样品包括速冻食品、乳制品、水产品、熟食、食用菌等，两种培养基检出率吻合，检验结果均无差异；统计100份样品中，两种显色培养基大肠杆菌的检出率分别为66%和65%，卡方检验结果显示二者没有显著差异（X2=0.22，P=0.882>0.05）。

2.3 两种培养基配对试验结果比较

对两种培养基上分离的疑似菌落进行纯化和API 20E鉴定，结果从两种平板上分离到3种假阳性菌株，其中HKM平板分离到4株，CHROMagar E平板上分离到5株，菌株分离鉴定结果如表2。表明两种显色平板都存在一定的假阳性。

表2 两种显色平板上假阳性菌株的分离鉴定情况Table 2 False positive strains from the two chromogenic media

3 讨论

显色培养基最大的优点是在分离培养的同时包括显色鉴定，这一过程只需18 h～24 h，大大缩短了检测时间，提高了检测效率。这种基于酶的试验方法具有简便、快速、准确、特异性好等优点，近年来，在临床诊断及食品微生物检验中显示了独特的优势[6-13]。目前，许多显色培养基已得到美国食品和药物管理局（FDA）、国际官方分析化学家协会（AOAC）等官方的认可，并逐步被引入到国内外各种标准检验方法中，用于食源性致病菌的快速检测。我国最新执行的食品安全国家标准GB4789-2010食品微生物学检验中，已引入显色培养基作为分离培养基，将显色培养基与前增菌和选择性增菌等步骤相结合，可以显著提高目标菌的检出率。

市场上现有的显色培养基产品中，法国科玛嘉的系列显色培养基是国内外普遍认可和广泛应用的产品，质量稳定，但价格相对较高。国内广东环凯微生物科技有限公司近年来也推出了一系列的显色培养基产品。本试验中，我们随机采集了广州市区各类食品样品进行检验，比较了两种大肠杆菌显色培养基的应用效果。总体而言，两种培养基的检测效果基本相当，将增菌液划线接种显色培养基18 h～24 h后，根据蓝绿色菌落的有无就可初步判断结果。大肠杆菌在两种培养基上都呈现蓝色-绿色菌落，在HKM平板上，目标菌的颜色稍浓于CHROMagar E显色培养基，分析可能是培养基中加入了更高浓度的显色底物，使菌落显色更深；而在非目标菌的抑制方面，CHROMagar E培养基的抑菌效果更好一些，杂菌生长相对较少。从阳性样品的检出情况来看，此次抽检的100份食品样品中，99份样品的检测结果吻合，1份样品检测结果有差异（生菜、样品号54#），两种培养基的检出率经卡方检验没有显著性差异。54#样品CHROMagar E检测结果阴性而HKM检测阳性，将HKM平板上分离的菌株采用API 20E条进行鉴定，结果证实为大肠杆菌（API数值编号：5444573，93.2%，good identification），即 CHRO Magar E培养基出现1份假阴性结果。CHROMagar E出现漏检可能与培养基中加入的抑菌剂成分或者高浓度有关，通常情况下，为了提高样品中目标菌的检出率，显色培养基中会加入特定种类和浓度的抑菌剂，抑制其他杂菌的生长，尽管抑菌剂可以起到抑制杂菌的目的，但是某些情况下也会对目标菌生长造成一定影响，特别是当样品成分复杂、目标菌活力较低、处于非可培养状态时，高浓度的抑菌剂可能影响目标菌的复苏和检出。

此外，在两种平板上，除了检出目标菌外，都有假阳性菌株分离到。由于实际样品中细菌种类繁多，不排除某些细菌会有与目标菌同样的酶，即某些非大肠杆菌的细菌也会存在大肠杆菌所具有的β-D-葡萄糖苷酶，在显色培养基上呈现与目标菌同样的颜色，因此可能会有假阳性结果出现。对于假阳性的结果，需要检验人员根据经验来判断。

显色平板毕竟是基于生化特点设计的培养基，不可避免会出现假阳性和假阴性的结果。事实上，显色培养基自推出和使用以来，其技术和配方也在不断改良和优化中。收集大量实际样品和实验菌株进行验证是其中最常用的手段，一方面通过优化基础配方和显色剂种类及浓度，使得目标菌利于复苏和生长，显色清晰可辨；一方面，选择更为高效的抑菌剂最大程度地减少非目标菌的生长，逐步提高显色培养基的特异性，最终目的使得检测结果更准确，更能接近和真实反映样品中致病菌的污染情况。

由于本实验所涉及的样品种类和数量有限，实际样品中可能还会出现各种各样不可预知的情况，所以要评价大肠杆菌显色培养基的应用效果，还需要大量样本加以验证。另外，对于假阳性和假阴性结果，在实际应用中，可尽量挑取较多的疑似菌株进行鉴定，同时可平行使用多个平板，减少检测果误差，提高检测结果的准确性。

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