微波提取下用HPLC测定油炸食品中的丙烯酰胺

田大年，汪岭，丁润梅

（1.宁夏医科大学公共卫生学院，宁夏 银川 750004；2.宁夏医科大学高等卫生职业技术学院，宁夏 银川 750004）

长期以来，食品安全一直是人们最为关注的问题，自2002年4月瑞典国家食品管理局（NFA）公布一些高温油炸和焙烤的淀粉类食品中含有丙烯酰胺（acrylamide，AA）以来，食品中AA的污染受到国际社会和各国政府的高度关注[1]。2005年2～3月，WHO和FAO对食品中的丙烯酰胺进行系统的危险性评估，认为食物是人类丙烯酰胺的主要来源，并呼吁世界各国采取措施以减少AA带来的危害[2]。同年9月，我国卫生部公布《食品中丙烯酰胺的危险性评估》报告，提醒人们改变以食用油炸和高脂肪食品为主的饮食习惯[3]。我国传统的早餐食物如油饼、油条等，由于食用人群广、食用频率高、食用量大等原因，是人群中丙烯酰胺摄入的主要来源之一，而且油饼、馓子是我区回族人口餐桌必不可少的食品，因此油炸食品中AA的测定更具有深远的意义。

丙烯酰胺（CH2=CH-CONH2）为小分子白色结晶状固体，溶于水、甲醇等溶剂，在室温和稀酸性条件下稳定，AA在食品中也较稳定，遇碱水解成丙烯酸。丙烯酰胺除了具有一般毒性外，还具有神经毒性、遗传毒性、致癌性以及生殖毒性[4]。因此，快速、准确的检测出食品中的丙烯酰胺更凸显其重要。目前，对丙烯酰胺的检测方法主要有GC-MS法、LC-MS法、LCMS-MS法等[5-7]，但因其均采用质谱检测器，虽定性准确，但样品前处理步骤多且相对复杂，检测时间长，操作步骤繁琐；另外所用检测仪器价格昂贵，分析成本高。因此，不适于普通实验室的普及应用。鉴于以上原因，本论文采用高效液相色谱仪，用微波提取，外标法对银川市油炸淀粉类食品中的丙烯酰胺进行测定，显示了良好的结果。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 试剂

正己烷：上海国药集团；甲醇，色谱纯：上海国药集团；丙烯酰胺标准品：分析纯；纯净水：杭州娃哈哈集团。

1.1.2 仪器型号

仪器D-2000 Elite高效液相色谱仪：日本日立公司；旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器公司；循环水式真空泵：河南郑州科工贸有限责任公司；家用微波炉：格兰仕；分析天平：梅特勒公司；500 mL分液漏斗；10 mL具塞比色管；100 mL量筒；100 mL容量瓶；50 mL容量瓶；50 mL具塞锥形瓶；普通漏斗；移液管；烧杯。

1.2 样品采集

1.2.1 采集

样品选取油条、馓子、油饼3种。其中，油条分别来自宁夏某高校食堂、泰和豆浆、沙湖宾馆；馓子分别来自北京华联、宁夏某购物中心、老大楼；油饼分别来自北京华联、迎宾楼、新百连超胜利南街店。每种3份，共9份。

1.2.2 样品均质

将油条的3份样品尽可能剪成小颗粒，并充分研磨且混匀，采用四分法称取10 g样品各3份待测。馓子、油饼均质方法相同。每种油炸食品的待测样品各3份，均为 10 g。

1.3 样品前处理

称取10.0 g均质后的油炸食品，加入约30 mL甲醇，充分浸润样品，静置，将样品放入微波炉，调节合适的功率，使之保持微沸状态，提取10 min，过滤，取滤液于烧杯；剩余残渣加入10 mL甲醇，继续提取10 min，过滤，取滤液，合并前后两次滤液于分液漏斗中，向分液漏斗中加入30 mL正己烷，充分振荡静置分层后，去除上层油脂层，取下层清液于分液漏斗重复萃取三次后下层清液过滤于50 mL容量瓶，用甲醇定容，用旋转蒸发仪蒸馏定容后的样品液，将待测样品容量最终定容为5 mL。各样品均采用上述处理方法，油条、油饼、馓子三种油炸食品均得到三份样品待测溶液。

1.4 高效液相色谱分析

1.4.1 色谱条件

Agilient RP—C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇：水溶液（5∶95，体积比）；流速为 0.8 mL/min；进样量为 5 μL；响应时间：0.5 s；DAD 检测器（监测波长为210 nm）；柱温为40℃。

1.4.2 定性分析

用丙烯酰胺标准品制得标准品应用液测定丙烯酰胺的保留时间，样品的定性分析采用与标准品的保留时间相对照的方法进行。

1.4.3 定量分析

样品处理后进行色谱分析，所得的峰面积与标准工作曲线相比较，通过计算得出样品中丙烯酰胺的实际浓度。

1.5 标准曲线

准确称取丙烯酰胺标准品（分析纯）0.100004 g，用甲醇∶水（5∶95）溶液溶解，定容于 100 mL 容量瓶，此时丙烯酰胺原液为1000μg/mL。准确配制浓度梯度为1、2、5、8μg/mL 的标准系列。

对上述标准系列溶液，在1.4.1的色谱条件下进样，RP-HPLC测定，浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线。

2 结果

2.1 试验条件的选择

2.1.1 检测波长的选择

检测波长的选择见图1。

图1由DAD检测器3D图所得平面图，如图示，丙烯酰胺在210 nm～250 nm范围内有紫外吸收，在接近210 nm处有最大吸收，因此确定最佳检测波长为210 nm。

2.1.2 流动相的选择

分别采用甲醇，甲醇∶水（50∶50）、水、乙腈，乙腈∶水（50∶50）等流动相洗脱，发现流动相为甲醇∶水（5∶95）条件下，干扰少丙烯酰胺能够达到较好的分离。

图1 标准品丙烯酰胺紫外吸收光谱Fig.1 Standard ultraviolet absorption spectrum of acrylamide

2.1.3 流量和进样量的选择

选择了 0.5 mL/min～2.0 mL/min 流量，2 μL～15μL进样量以及C=1.0μg/mL的标准溶液进样。发现在流速0.8 mL/min，进样量为5 μL，峰形以及出现时间及分离度比较良好。

2.2 样品前处理方法选择

2.2.1 提取溶剂及萃取剂的选择

丙烯酰胺为极性化合物，提取一般采用水货强极性物提取，采用甲醇提取得到了较好的效果，当用水提取时虽然其在水中的溶解度大，但是也将一些其他大极性的物质一起得到提取，影响到了丙烯酰胺的测定。有文献报道，用石油醚可将油脂萃取掉，试验结果不佳，后改为正己烷，效果较石油醚好，能去掉油脂。

2.2.2 样品液的浓缩

样品处理液中丙烯酰胺含量较低，虽能分离，但是容易受到噪音干扰无法明显的分离，因此对其进行了浓缩，用旋转蒸发仪蒸馏出部分甲醇，最后将其用甲醇定容至5 mL，待测。

2.3 丙烯酰胺标准品测定结果

2.3.1 丙烯酰胺标准品浓度

1、2、5、8μg/mL。标准品在 1.4.1 的色谱条件下分离峰型较好，且保留时间均为5.61 min，见图2。

图2 标准品色谱图（以5μg/mL的丙烯酰胺标准液为例）Fig.2 Standard chromatogram（5μg/mL standard of acrylamide）

2.3.2 丙烯酰胺标准曲线绘制

标准系列在1.4.1的色谱条件下进样，RP-HPLC测定，浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线，在1μg/mL～8μg/mL的浓度范围内，线性关系良好，相关系数R2=0.9989，所得回归方程为Y=6.844 E10-5X-5.787E10-1。

2.4 样品测定结果

2.4.1 样品色谱图

样品色谱图如图3、4、5所示。

图3 油条样品色谱图（以样品油条1为例）Fig.3 Chromatogram of Fried bread stick sample（Fried bread stick sample 1）

图4 油饼样品色谱图（以样品油饼2为例）Fig.4 Chromatogram of oil cake sample（oil cake sample 2）

图5 馓子样品色谱图（以样品馓子1为例）Fig.5 Chromatogram of San zi sample（San zi sample 1）

2.4.2 油炸淀粉类食物中丙烯酰胺测定结果

银川市市售油炸淀粉类食物（油条、油饼、馓子）中均检测出丙烯酰胺的存在，其含量范围在1.862μg/g～19.664μg/g，结果见表 1。

2.5 HPLC的精密度与加标回收率

2.5.1 精密度的测定

标准系列浓度1、5μg/mL同样色谱条件下重复进样6次，其RSD分别为3.36%、2.33%。

表1 银川市油炸淀粉类食物中丙烯酰胺的分析结果Table 1 The result of AA found in yinchuan fried starchy foodsμg/g

2.5.2 加标回收率

称取阴性样品（面粉）10 g，分别添加丙烯酰胺标准液各1 mL，静置5 min.按1.3和1.5进行回收率实验，每个添加水平做平行3次，分离结果见图6。

图6 阴性加标回收分离色谱图Fig.6 Chromatogram of negative recovery

计算回收率和精密度，结果如表2所示。

表2 不同添加水平的丙烯酰胺回收率（n=3）Table 2 Effect of different addition of AA recovery（n=3）

3 分析结果讨论

试验结果显示3种油炸食品中丙烯酰胺的含量分别为：油饼（19.103μg/g）＞ 馓子（12.615μg/g）＞ 油条（1.887μg/g）。分析其主要原因在于制作工艺的不同：由于油饼单个体积较大，含淀粉较多，炸的时间较长，但为其色泽金黄，该过程通常选用七八成火（不超过200℃），因此，油温可以较稳定的保持在一定高度，而丙烯酰胺产生的最适宜温度在140℃～180℃，因此油饼中丙烯酰胺有较高产出[8]；馓子由于其为了达到酥脆的口感，在火候的选择上与油饼相似，但由于其制作时加入硫酸铝钾和碳酸钠，油炸时，在高温作用下，矾碱中和反应更快，油的高温会蒸发掉面团中的水分，并且，在调制面团时掺入盐，由于盐的渗透作用，把面团中蛋白质的一部分水渗出来，所以馓子的水分含量低于油饼，因为，水分含量越低，丙烯酰胺含量越高，可能由于馓子制作中加入别的非淀粉类物质，造成淀粉物质所占比重较少，还有水分含量对丙烯酰胺含量的影响被长时间的油炸所掩盖；油条在制作中也发生矾碱反应遇高温膨松，油温通常高于油饼油条，且油炸时间小于油饼油条，口感外酥里嫩，水分含量高于馓子，所以其丙烯酰胺的含量较三者相比最低[9]。

4 结论

研究发现在微波作用下能够将油炸食品中的丙烯酰胺提取出来，HPLC检测发现在宁夏回族人口中所食用的油炸食品中油饼中的丙烯酰胺含量较高，馓子中的含量次之，油条含量较少。而油饼及馓子作为回族人口餐桌必不可少的食品，如何减少其中的丙烯酰胺的含量成为食品加工的重要课题。

本次实验分析方法的RSD小于5.32%，仪器精密度测定RSD小于3.36%，阴性加标回收率为78.6%～110.2%，说明实验可信度较好，结果较准确，且方法简便，快速。

[1]Tareke E,Rydberg P,Karlsson P,et al.Analysis of acrylam ide,a carainogen formed in heated foodstuffs[J].J Agric Food Chem,2002,50:4998-5006

[2]Konings EM,Baars AJ,van Klaveren JD,et al.Acrylamide exposure from foodsofthe Dutch population and an assement of theconsequent risks[J].Food Chem Toxicol,2003,41(11):1569-1579

[3]孙长颢,孙发秀,凌文华.营养与食品卫生学[M].6版.北京:人民卫生出版社,2007:324-327

[4]金庆中,赵立文,徐筠,等.北京地区居民酰胺膳食摄入量的研究[J].卫生研究,2006,35(5):631-633

[5]王玉君,缪维芳,张文德.食品中丙烯酰胺及其检测方法[J].中国卫生检验杂志,2006,16(4):495-497

[6]宋莉晖,杨成.食品中丙烯酰胺含量的分析方法研究[J].食品科学,2005,26(6):203-205

[7]李吉平,刘文森,高宏伟,等.固相萃取联用法测定食品中丙烯酰胺含量的研究[J].食品科学,2007,28(2):250-254

[8]林流丹,黄才欢,欧仕益.食品中丙烯酰胺形成机理的研究进展[J].现代食品科技,2006,22(1):167-170

[9]于胜弟,黄卫宁,邹奇波.中式油条中丙烯酰胺含量的研究[J].食品科学,2008,29(4):143-148