山苦茶的复合保鲜剂对冷却肉保鲜效果的研究

闫佳，李跃萍，闫庆峰，韦祎

（海南医学院营养与食品卫生学教研室，海南 海口 571101）

我国是肉类生产大国，冷却肉是指严格执行兽医检疫制度屠宰后的畜禽胴体迅速进行冷却处理，使胴体温度（以后腿肉中心为测量点）在24 h内降为0℃～4℃，并在后续加工、流通和销售过程中始终保持0℃～4℃范围内的生鲜肉，它比冷冻肉具有更佳的口感与营养。因此冷却肉货架期引起人们关注。决定冷鲜肉货架期和微生物安全性的主要因素是原料肉初始菌数及其保鲜处理方式。表面减菌化处理常用的天然保鲜剂有木犀草素、茶多酚及各种植物的提取物等[1]。

茶多酚是一类以儿茶素为主体的多羟基的酚类物质，有抗脂质氧化和抑菌的作用[2]，木犀草素也有抑菌抗氧化作用[3]。山苦茶是海南民间的一种具有浓郁地方特色和民族特色的代茶饮料植物和重要的药用植物[4]，有抗菌和抗病毒作用。根据栅栏技术，将这3种天然防腐剂有效组合，探索延长冷却肉保质期的技术。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌：假单胞菌、乳酸菌、热死环丝菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌。

生物防腐剂为茶多酚，木犀草素，山苦茶浸出物（在海南茶叶店购买山苦茶100 g，50目粉碎后，采用茶∶纯净水=1∶100（g∶g），用 85 ℃纯净水浸泡 30 min，用抽滤机过滤，合并3次浸提茶汤，减压浓缩并烘干，得5 g山苦茶浸出物，装瓶，低温4℃冷藏）。

主要设备为DHP-9052恒温培养箱、BPH-9050A鼓风干燥箱：上海申贤恒温设备厂；BCD-268WBCS冰箱：海尔；JB-FY-900/900U超净工作台：苏州佳宝净化工程设备有限公司；DK-400S真空封口机：深圳市安德利包装设备有限公司；滤纸圆片（打孔器将厚1.5 mm厚滤纸打成直径6 mm圆片）、康威氏皿等。

1.2 方法

1.2.1 天然防腐剂制备

将茶多酚、木犀草素、山苦茶浸出物用无菌蒸馏水配成不同浓度备用。

1.2.2 滤纸片法

滤纸片法实验步骤：将厚度1.5 mm直径6 mm圆片包装后160℃干热灭菌2 h；将各供试菌的选择性培养基倒入干热灭菌后的培养皿内，凝固后使用；在无菌室里挑培养的菌落放入10 mL无菌蒸馏水中，磁力搅拌均匀，成为含菌106cfu/mL～107cfu/mL的菌悬液；用灭菌后的吸管吸0.2 mL各供试菌悬液于平皿内，用无菌三角玻璃棒将其涂匀；将滤纸片放入茶多酚、山苦茶浸出物、木犀草素的不同浓度液中浸泡1 min，取出甩干贴于平板上。各平皿放6个（同一抑菌液不同浓度5个和空白对照组）滤纸片，每种抑菌液做3个平板重复；将平皿倒置放于恒温箱中，按各菌的最适培养温度培养24 h；用测微尺测各抑菌圈大小。

1.2.3 抑菌能力测定

采用滤纸片法测定抑菌圈直径，抑菌圈直径6mm表示无抑菌能力（-），6mm～10mm 抑菌力弱（+），10 mm～12 mm抑菌力较强（++），12 mm以上抑菌力强（+++）。

1.2.4 肉样处理

用75%酒精棉球擦刀具和面板，将购回的冷却肉分别去筋膜，切成100 g的肉块，随即分为20组，每组3块。将其放入以蒸馏水为溶剂的按设计安排的实验组配制各组保鲜液中及空白对照（无菌蒸馏水）浸泡1 min，取出自然滤干2 min～3 min，采用聚偏氯乙烯真空包装袋，真空包装后，贴上标签，放入0℃～4℃冰箱中贮藏定期测细菌总数和TVB-N值。

1.2.5 细菌总数的测定

按GB/T 4789.2-2008《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》进行。

1.2.6 TVB-N（挥发性盐基氮）的测定

按GB/T 5009.44-2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》测定。

2 结果与分析

2.1 3种天然防腐剂的抑菌圈直径和抑菌力

冷却肉上几大类菌所占比例基本一致，假单胞菌属占25%～26%，乳酸菌20%～21%，热死环丝菌占12%～13%，葡萄球菌属和微球菌占12%～15%，酵母菌和霉菌占5%～6%，肠杆菌科差异较大在19%～26%之间。冷却猪肉中初始菌相包括假单胞菌、乳酸菌、热死环丝菌、肠杆菌科、葡萄球菌属、微球菌属及少量酵母菌。其中以假单胞菌属为优势[5]。

本实验里，3种天然防腐剂分别对假单胞菌、乳酸球菌、热死环丝菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌抑菌力分别见表1。

表1 3种天然防腐剂对5种腐败菌的抑菌力Table 1 The antimicrobial strength of different preservatives on spoilage bacteria

2.2 复合保鲜液模型的建立与统计分析

因为每种天然防腐剂的抑菌谱不一致，单一食品防腐剂不能有效地抑制和杀灭所有微生物。根据栅栏技术的原理，将不同种类天然防腐剂按一定比例混合，发挥其协同作用，增强其抑菌效果，降低单一防腐剂的用量，达到综合保鲜的目的。

结合前面3种天然防腐剂采用滤纸片法实验所得结果，将茶多酚、木犀草素、山苦茶浸出物三因素，采用三因子二次通用旋转设计进行实验。实验的因素水平编码见表2。表3的Y值采用细菌总数抑菌率。

表2 因素水平编码表Table 2 The facter levels of design

对实验所得的抑菌率求平均值，进行统计分析。根据三因子二次通用旋转设计统计软件WHG52对表3的数据进行处理，结果如下：偏回归系数B（1）＝0.528 B（2）＝0.637 B（3）＝0.4959 偏回归系数 F 测验表明F（1）=9.19*、F（2）=11.03**、F（3）=6.68*、失拟检验 F=0.98、拟和检验 F2=4.30*，回归方程 Y=86.13-0.233X12+0.068X22+0.510X32+0.582X1+0.637X2+0.496 X3-0.188 X1X2-0.238 X1X3-0.188 X2X3。

对此方程进行F检验得出失拟检验差异不显著，拟和检验差异显著。失拟检验不显著，说明本设计所考虑的因子足以反映3种保鲜剂对猪肉中腐败菌抑菌效果的影响，不存在不可忽视的因子，拟和检验差异显著，说明此回归方程在本实验中有意义。此回归设计对数据进行了中心标准化，消除了量纲上的差异，可以直接从回归系数绝对值的大小来分析各因子对猪肉中腐败菌抑菌效果的影响力。从回归方程可知，3个一次项回归系数绝对值大小依次为B2B1B3，说明茶多酚对抑菌效果影响最大。通过各回归系数进行F检验可知，3种保鲜剂对样品的抑菌效果均有显著影响（P<0.05）。

表3 3种防腐剂因素水平码值表和试验结果Table 3 The factors quadratic design of three preservatives andresult

得出3种保鲜剂的最佳添加量组合是：木犀草素0.010%、茶多酚0.125%、山苦茶浸出物0.013%。

2.3 最佳组合保鲜剂处理的猪肉在冷藏期间细菌总数变化和TVB-N值的变化

将添加量为木犀草素0.010%、茶多酚0.125%、山苦茶浸出物0.013%的最佳组合保鲜液按1.2.4的方法处理肉样，真空包装后，0～4℃贮藏，定期测定细菌总数和TVB-N值。

图1 不同处理贮藏过程中细菌总数变化Fig.1 The changes of the total bacteria counts of different treat

图2 不同处理贮藏过程中TVB-N变化Fig.2 The changes of the TVB-N value of different treat

肉的腐败变质主要是由于细菌繁殖以及酶作用的结果，造成蛋白质被分解而产生氨及胺类等碱性含氮物质，通过测定细菌总数和挥发性盐基氮的生成量，可判断肉的新鲜度[6]。国家卫生标准规定：当肉的TVB-N值大于25 mg/100 g，细菌总数大于108cfu/g，为腐败肉[7]。

从图1和图2可以看出，组合保鲜剂处理的猪肉在0℃～4℃冷藏期间细菌总数和TVB-N值明显均低于对照组。各组在0℃～4℃贮藏的前9天处于缓慢上升状态，之后逐渐变快。原因主要是原料肉的初始菌数较低，再加上保鲜液的抑菌作用，使引起冷却肉腐败的细菌不能快速生长繁殖而分解蛋白质。

实验测定得出0℃～4℃冷藏，对照组保鲜期为20d，组合保鲜剂处理组保鲜期为26 d，说明：木犀草素0.010%+茶多酚0.125%+山苦茶浸出物0.013%组合保鲜剂对对冷却猪肉进行表面减菌化处理能有效控制微生物增值，延缓肉的腐败变化速度。

3 结论

首先测定山苦茶浸出物、茶多酚、木犀草素3种天然防腐剂对冷却肉中常见菌的抑菌效果，根据栅栏技术，发挥协同效应，利用三因子二次正交旋转设计，确定最佳的保鲜液配比为木犀草素0.010%+茶多酚0.125%+山苦茶浸出物0.013%。用此保鲜液浸泡肉样1 min，取出自然滤干2 min～3 min，用聚偏氯乙烯真空包装袋真空包装后，放入0℃～4℃冰箱中，通过测定在冷藏过程中肉样的细菌总数、TVB-N，表明了此保鲜液与对照组相比，对冷肉的保质期可延长6 d。

[1]王金枝,孔保华,刁新平.冷却肉保鲜的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医,2004(5):66-67

[2]陶荣达.茶多酚的制备和应用研究的进展[J].化学世界,1997(2):64-67

[3]陈春涛.花生壳中木犀草素等抑菌活性成分的提取、纯化与研究[J].食品科学,2003,24(5):85

[4]林海,麦光大,唐小山,等.山苦茶的抗菌和抗病毒作用研究[J].中国药科大学学报,1993,24(3):235

[5]Leistner L.Food preservation by combined methods[J].Food research international,2002,125(6):151

[6]吴信法.畜产食品兽医卫生检验手册[M].上海:上海科学技术出版社,1998:114

[7]金铺建.肉类加工企业的卫生管理[M].北京:中国轻工业出版社,1993:82