伊犁地区乳品中乳酸菌的分离及鉴定

尚天翠，刘影，卫刚

（1.伊犁师范学院化学与生物科学学院，新疆 伊宁 835000；2.新疆伊宁卫生学校专业基础学科，新疆 伊宁 835000）

乳酸细菌（Lactic Acid Bacteria，LAB）是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸而多数不能分解蛋白质的革兰氏阳性细菌的统称。这类细菌在自然界分布极为广泛，与人类生活有着密切的关联。多数有益乳酸菌在其发酵食品及产物中不形成任何毒素或有毒产物，产生乳酸及一些芳香物质而直接提高发酵食品的营养价值和可口性。

伊犁哈萨克自治州地区制作乳酸发酵奶食品的资源非常丰富，并且有传统的制作经验。该区的少数民族，如哈萨克族和维吾尔族以牛乳、羊乳、马乳和骆驼乳等为原料，采用传统工艺加工各种发酵乳制品，产品的加工方法虽然比较简单，但风味纯真独特，这与该区特殊的自然环境以及其中分布的微生物种群有着密切关系，因此，探明这一地区乳酸菌的种类十分必要。本文对伊犁地区的乳及乳制品样品进行了采集，并进行了乳酸菌的分离、鉴定和详细生物学特性的研究，旨在为开发利用这一地区特有的乳酸菌资源，促进该区乳制品工业的发展提供参考，同时，也为微生物生态学积累资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品来源

2009年4月采集伊犁哈萨卡自治州伊犁昭苏牧场酸驼奶（编号ST），伊犁伊宁县驼奶（编号TO），伊犁果子沟酸牛奶（编号SN）和伊宁市牛奶（编号NO）各1份。样品存放于灭菌采样瓶中，置于冰盒中4℃存放，直至运回实验室。

1.1.2 标准菌株

德氏乳杆菌保加利亚亚种（L.delbrueckii subsp.bulgaricus.CGMCC 1.1863）、乳酸乳球菌乳酸亚种（L.1actis subsp.lactis.CGMCC 1.1936）、肠膜明串珠菌葡聚糖 亚 种 （L.mesentaroids subsp.dextranicum.CGMCC 1.17）：购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.1.3 培养基

MRS培养基、BCP培养基、LB培养基按文献[1-2]的方法配制；而其他生理生化试验和糖类发酵试验用培养基和试剂等均按文献[2-5]的方法配制。

1.2 实验方法

1.2.1 乳酸菌的计数及分离

将乳品经过温度、pH测定后，进行乳酸菌的分离和纯化：将乳品用灭菌生理盐水10倍递增稀释至10-4、10-5两个稀释度。乳酸菌计数采用倾注法[6]。

将乳品10-4、10-5稀释液用灭菌接种环划线接种于MRS琼脂培养基上培养24 h～72 h，然后挑取有透明环的单个菌落，接种到MRS琼脂培养基和BCP培养基上纯培养，纯化后再接种到MRS琼脂培养基和BCP培养基培养后，置4℃冰箱中保存、备用[7]。

1.2.2 菌株的形态、染色特性及菌落特性观察

观察培养后的乳酸菌的形态和培养特征并记录。

取各种单菌落涂片，用革兰氏染色法染色，在显微镜下观察，记录其形态特征，并进行显微照相。

1.2.3 乳酸菌的鉴定及其生物学特性的研究

根据文献[6，8-9]，革兰氏阳性，过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、联苯胺反应试验等为阴性，在MRS平板培养基上菌落周围形成明显的透明环的所有分离菌，均初步鉴定为乳酸菌（杆菌或球菌）。在确定为乳酸菌的前提下，进一步进行明胶液化试验、吲哚试验、产生硫化氢试验、不同pH培养试验、不同温度培养试验、耐盐性试验、美蓝还原试验、糖发酵试验等试验，将乳酸菌属分离菌株鉴定到种。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的计数和分离

伊犁地区乳品中乳酸菌的计数与分离结果见表1。

表1 乳酸菌的计数和分离Table 1 Counting and isolation of lactic acid bacteria

从表1可以看出，乳酸菌数量在6.48×107mL-1～1.12×109mL-1之间，并且4种乳样中共分离出10株乳酸菌，其中杆菌4株、球菌4株、明串珠菌2株。并且从表中我们还可以看出，酸驼奶和酸牛奶中乳酸菌的种类明显高于其他样品。

2.2 乳酸菌菌株的形态、菌落特性及染色特性

2.2.1 乳酸菌菌株的形态及菌落特性

本研究分离的菌株在MRS培养基上生长48 h后，菌落外周形成大小不同的透明区，而在BCP培养基上生长后，菌落周围的颜色由蓝紫色变成黄色[5]。从培养好的平板中，挑取10个不同的单菌落，逐个编号，根据菌落识别要点，识别乳酸菌的培养特征结果见表2。

表2 未知乳酸菌菌落的形态特征Table 2 Morphological characteristics of unknow lactic acid bacteria

从表2可以看出，分离的杆菌在MRS培养基上形成圆形光滑、比较厚、大小0.5 mm～3 mm左右的乳白色、表面光滑、边缘整齐、透明隆起的菌落，如ST3，SN2，NO2，TO1。

分离的球菌在MRS培养基上形成圆形光滑、比较薄、大小0.5 mm～2 mm左右的乳白色、表面光滑、边缘整齐、透明扁平的菌落，如 ST1，ST2，ST4，SN1，NO1，TO2。

2.2.2 乳酸菌菌株的染色特性

分离的菌株经革兰氏染色，用E221LED型光学显微镜放大40倍观察结果为：呈革兰氏染色阳性，有单个、成对或链状排列的短或长杆菌以及单个、成对或链状排列的球状菌或杆状菌，如图1。

2.3 乳杆菌属种（Lactobacillus）的鉴定结果及其生物学特性

乳杆菌属种的鉴定结果见表3、表4。

图1 各种乳酸菌的形态观察Fig.1 Morphologic observation of different lactic acid bacteria

表3 乳酸菌的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of lactic acid bacteria

表4 乳酸菌糖发酵试验鉴定结果Table 4 Fermentation characteristics of lactic acid bacteria

表3、表4中所列的4株革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、联苯胺试验、吲哚试验、H2S产生试验和明胶液化试验中呈阴性，均不运动，能在pH为4.5中生长的杆状菌株鉴定为乳杆菌属的细菌。被鉴定的4株菌的共同特点是都能在10℃和45℃条件下生长，不产生氨的同型发酵型菌株。菌株ST3、SN2、NO2、TO1能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖等单糖，也能发酵蔗糖、纤维二糖、果糖等双糖，能利用松三糖，不能发酵鼠李糖，乳酸旋光性为DL，因此为干酪乳杆菌假植物亚种（L.casei subsp.Plantaman）。以上4株菌在45℃均能生长，都有耐热性，不能耐受pH6.5的NaCl，但对pH9.6的NaOH有耐受性，可被0.1%美蓝还原。

2.4 球形乳酸菌属的鉴定结果及生物学特性

上述分离到的6株球菌，进行了硝酸盐还原试验、硫化氢产生试验、联苯胺试验、明胶液化等生理生化反应试验，最终将6株菌株归属于下列3个属，见表3。

2.4.1 肠球菌属种（Enterococcus）的鉴定结果及其生物学特性

表3、表4中，ST1，SN1菌株在过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、联苯胺试验、苯丙氨酸脱氢酶试验均为阴性，在10℃和45℃都生长的革兰氏阳性球状菌，鉴定为肠球菌属的细菌。这两株菌均能在pH9.6和6.5%NaCl环境中生长，均能还原0.1%美蓝，能水解精氨酸，将能分解木糖、棉子糖、蜜二糖，对阿拉伯糖有一定分解能力的ST1菌株鉴定为鸡肠球菌（E.gallins.rum）；将能利用柠檬酸盐，而不利用鼠李糖、山梨醇的SN1菌株鉴定为屎肠球菌（E.faecium）。

2.4.2 乳球菌属种（Lactococcus）的鉴定结果及其生物学特性

在表3、表4中，ST2，NO1菌株在10℃和40℃都生长，在45℃不生长，不能在6.5%NaCl环境中生长，能还原0.1%美蓝，不运动，能耐受pH9.6的碱性环境，精氨酸不产氨，能分解蔗糖和麦芽糖，不能利用蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露糖醇、山梨醇，因此将这两菌株鉴定为乳酸乳球菌乳酸亚种（L.lactissubspcremoris）。

2.4.3 明串珠菌属种（Leuconostoc）的鉴定结果及其生物学特性

表3、表4中所列的ST4，TO2菌株，革兰氏染色为阳性，球状成对或链状排列，在过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、联苯胺试验、苯丙氨酸脱氢酶试验、产氨试验、乙酰甲基甲醇（V.P.）试验、柠檬酸盐利用试验均为阴性，发酵葡萄糖既产酸又产气，可液化明胶，不水解精氨酸，不产生吲哚和硫化氢，在25、40、45℃均能生长但在10℃时不生长，能利用多种单糖、双糖、多糖，但对鼠李糖、棉子糖、松三糖和蜜二糖的利用能力较弱，因此这两菌株暂定为肠膜明串珠菌肠膜亚种（Lc.Mesenteroides subsp.Mesenteroides）。

3 结论与讨论

对伊犁地区牧民家庭中采集的乳品中的乳酸菌进行了分离和鉴定。结果表明：从4份样品中共分离到乳酸菌10株，并进行了种的鉴定，分到干酪乳杆菌假植物亚种（L.casei subsp.Plantaman）4 株、鸡肠球菌（E.gallins.rum）1 株、屎肠球菌（E.faecium）1 株、乳酸乳球菌乳酸亚种（L.lactis subsp.cremoris）2株、肠膜明串珠菌肠膜亚种（Lc.Mesenteroides subsp.Mesenteroides）2株。

所分离菌株均为中温菌，即10℃生长，40℃生长良好，其中 ST1、ST3、ST4、NO2、TO1、TO2、SN1、SN2 等8株在10℃和45℃培养均能良好生长。从生长温度结果看，乳球菌、肠球菌在10℃～45℃范围内具有较强的适应性，而明串珠菌在20℃～30℃（或称室温）环境下具有良好的生长特性。这表明，所分离菌株具有适应于该地区多变的气候和室内外温度等环境的能力。而且该地区乳酸菌微生态关系也较多样化，有单生，也有共生、互生和拮抗等现象。如：ST1，ST2，ST3与ST4、SN1与SN2、NO1与NO2、TO1与TO2为共生菌。乳酸菌微生态关系的探明对于不同菌株的功效解析有一定意义。如果将本项分离菌株合理组合，会得到具有独特风味的更好的新的乳制品。本次研究主要采用乳酸菌生理生化指标特性的表型鉴定方法，所以，鉴定试验结果个别菌株有些项目与标准不符。因此，更详细的归属研究分析有待结合分子生物学方法进一步进行。

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