克鲁维酵母菊粉酶的酶学特性研究

孔令坚，石勇，陈雄

（湖北工业大学生物工程学院，发酵工程省部共建教育部重点实验室，湖北 武汉 430068）

菊粉是由多个果糖分子通过β－2，1－果糖糖苷键连接而成的多聚果糖，末段有一个葡萄糖残基以α-1，2糖苷键与之相连，呈直链结构。菊粉广泛存在于一些菊科植物中，如菊芋、菊苣、大丽花等。其中菊芋是一个廉价的糖源，在我国大部分地区都有种植，亩产可达3000 kg～5000 kg，通常被作为食用或饲用原料，未获取其真正的价值，故急待开发利用[1-3]。

菊粉酶（inulinase，EC3.2.1.7）是一种主要来源于微生物的多糖水解酶，可分为内切型、外切型两种，其中内切型菊粉酶可水解菊粉β－2，1-果糖糖苷键生产高纯度的低聚果糖（fructooligosaccharides，FOS），外切型菊粉酶可水解菊粉生产超高果糖浆（Ultra High Fructose Glucose Syrups，UHFGS）[4-5]。

本实验室（湖北工业大学生物工程学院，发酵工程省部共建教育部重点实验室）分离了一株克鲁维酵母S120[6]，可产菊粉酶，本文探讨了该克鲁维酵母菊粉酶的酶学特性。

1 材料和方法

1.1 菌株

克鲁维酵母（Kluyveromyces）S120：由本实验室（湖北工业大学生物工程学院，发酵工程省部共建教育部重点实验室）筛选得到。

1.2 培养基

1.2.1 斜面培养基

葡萄糖20.0 g，酵母膏10.0 g，蛋白胨10.0 g，琼脂20.0 g，蒸馏水定容到1000 mL，pH自然。

1.2.2 种子培养基

酵母膏10.0 g，蛋白胨20.0 g，菊芋粉10.0 g，蒸馏水定容到1000 mL，pH 6.0。

1.2.3 固体发酵培养基

在300 mL三角瓶中加入18 g麸皮，2 g菊芋粉，另加入30 mL营养盐液（0.4%NH4SO4，3%KH2PO4,0.5%MgSO4·7H2O,0.0003%MnSO4·H2O,0.0008%FeSO4·6H2O,0.00025%ZnSO4·7H2O,0.00035%CaCl2），初始 pH5.7。

1.3 方法

1.3.1 接种和培养条件

挑取斜面活化菌种Kluyveromyces S120接入装有20 mL新鲜种子培养液的250 mL三角瓶中，30℃下150 r/min培养24 h，按4%接种量接种种子培养液，混合均匀，34℃下培养72 h，间时拍打，使其均匀生长。

1.3.2 酶液的制备与纯化

发酵结束后，在固体培养物加入1∶10（以干重计）的蒸馏水，于室温下（25±2）℃搅拌1 h，过滤，重复提取两次，合并滤液，滤液作为粗酶液。将粗酶液用50%～60%硫酸铵分级盐析、阳离子树脂交换纯化得到菊粉酶产品。

1.3.3 菊粉酶的测定

向试管中吸取一定稀释度的粗酶液1.0 mL，加0.1 mol/L醋酸盐缓冲液（pH 5.0）配制的2%菊粉液4 mL，混匀，于60℃保温30 min后置于沸水中10 min使酶失活，然后冷却到室温，产生的还原糖用3，5-二硝基水杨酸法（DNS法）测定。每个试验平行3次，试验结果取3次的平均值。菊粉酶（I）活力单位规定为：在上述条件下，每分钟产生1 μmol果糖所需的酶量为一个菊粉酶单位（U）。

1.3.4 蔗糖酶的测定

吸取一定稀释度的粗酶液1.0 mL，加0.1 mol/L醋酸盐缓冲液（pH 5.0）配制的2%蔗糖溶液4 mL，混合均匀，37℃反应30 min。用DNS法测定反应液中还原糖的量。以煮沸酶液作对照，每个试验平行3次，试验结果取3次的平均值。蔗糖酶（S）活力单位规定为：在上述条件下，每分钟水解1 μmol的蔗糖量。

1.3.5 菊粉酶酶学特性

1.3.5.1 菊粉酶的最适pH及酸碱稳定性

分别以pH 4.5～9.0的缓冲液配制底物和稀释酶液，测定酶活力，以酶活最高者为100%。将酶分别在pH 4.0～9.0的缓冲液中30℃放置1 h后，测定其残余酶活力，以未保温酶液的酶活力为100%。

1.3.5.2 菊粉酶的最适温度及热稳定性

在不同温度下测定酶活力，以酶活最高者为100%。在pH5.5条件下，将酶在30℃～60℃范围内保温1h后，测定其残余酶活力，以未保温酶液的酶活力为100%。

1.3.5.3 动力学常数测定

酶与底物在pH 5.5、50℃反应5 min，测定反应产物中还原糖的增加量，以单位时间内产物中还原糖的增加量作为酶反应的初速度，用Lineweaver-Burk双倒数作图。

1.3.5.4 金属离子对酶活力的影响

将酶液对重蒸馏水透析过夜，添加不同金属离子，测定其酶活力。以不加金属离子的酶活力为100%。

2 结果与讨论

2.1 内、外切型菊粉酶的确定

[7]，对于具有内切型、外切型菊粉酶活性的粗酶液，通常测其对2%菊粉溶液的活性（I）和2%蔗糖溶液的活性（S），计算出I/S值，一般认为当I/S大于10时，表现为内切酶活性。I/S小于10时，表现为外切酶活性。本试验首先确定Kluyveromyces S120的I/S值为13.5，I/S值大于10，为内切菊粉酶菌株。内切菊粉酶可水解菊粉产生低聚果糖。

2.2 酶学特性研究

2.2.1 pH对酶活力的影响

在pH 4.5～9.0条件下，通过多次平行试验，测定相对酶活力，所得结果见图1，将酶分别在pH 4.0～9.0的缓冲液中30℃放置1 h后，通过多次平行试验，测定其残余酶活力，结果见图2。

图1 pH对酶活力的影响Fig.1 Effect of pH on enzyme activity

图2 pH对酶稳定性的影响Fig.2 Effect of pH on enzyme stability

从图1中可知酶的最适pH5.5。低于或高于pH5.5，酶活都有所下降。在pH5.0～pH6.0之间，相对酶活力达90%以上；pH大于7，相对酶活力急剧下降，pH9.0后相对酶活力很低。从图2中可知该酶在pH 4.5～7.0范围内稳定，残留酶活达90%以上。pH影响酶活的原因有：过碱会影响酶蛋白的结构，甚至使酶变性失活；pH也可能影响酶分子中一些基团的解离，从而影响酶的活性。

2.2.2 温度对酶活力的影响

在pH 5.5条件下，30℃～60℃范围内通过多次平行试验，测定相对酶活力，结果见图3。将酶分别在30℃～60℃放置1 h后，通过多次平行试验，测定其残余酶活力，结果见图4。

图3 温度对酶活力的影响Fig.3 Effect of temperature on enzyme activity

图4 温度对酶稳定性的影响Fig.4 Effect of temperature on enzyme stability

如图3所示，在温度为50℃时，酶活力最高。如图4所示，在50℃～60℃间能维持80%以上的酶活力。温度对酶促反应的影响有两方面：一方面是当温度升高时反应速度会加快；另一方面是随着温度的升高，酶逐渐变性。酶的最适温度是这两种过程的平衡效果，在低于最适温度时，前一种效应为主，因而酶的活性增加；在高于最适温度时，后一种效应为主，因而酶的活性迅速降低。

2.2.3 金属离子对酶活力影响

将酶液对重蒸馏水透析过夜，通过添加不同金属离子，测定其酶活力。不同金属离子对产酶的影响见图5。

由图5可知，锰离子、镁离子、钙离子对菊粉酶的激活作用最显著，而锌离子，铜离子，亚铁离子有抑制作用。

图5 金属离子对酶活力影响Fig.5 Effect of metal ion on enzyme activity

2.2.4 米氏常数与最大反应速度

菊粉酶经过初步纯化后，在5 min时间内，酶量一定及酶促反应最适条件下，改变底物浓度（s），测产物浓度（p），初速度设定为 ΔP/t。按 Lineweaver-Burk作图法以1/V对1/S作图，如图 6，得到 1/V=0.6763（1/S）+0.0636，根据直线在横轴上的截距（－1/Km）求出米氏常数Km为10.63 mg/mL，最大反应速度为15.72 mg/（mL·s）。

图6 底物浓度与反应速度的关系Fig.6 Relation of substrate concentration and reaction velocity

3 结论

克鲁维酵母S120菊粉酶为内切菊粉酶。其最适pH5.5，最适温度50℃，锰离子、镁离子、钙离子对菊粉酶的激活作用最显著，而锌离子，铜离子，亚铁离子有抑制作用。在试验条件下，米氏常数Km为10.63 mg/mL，最大反应速度为15.72 mg/（mL·s）。

参考文献：

[1]张连富,李红.内切菊粉酶法生产低聚果糖研究进展[J].中国食品添加剂,2000(1):20-25

[2]Kulminskaya A A,Arand M,Eneyskaya E V.Biochemical characterization of aspergillus awamori exoinulinase:substrate binding characteristics and regioselectivity of hydrolysis[J].Biochimica and biophysica acta,2003,1650(1):22-29

[3]Vandamme E F,Derycke D G.Microbial inulinases:fermentation process,properties and applications[J].Adv Appl Microbiol,1993,29:139-176

[4]Gennaro S D,Birch G G,Parke S A.Studies on the physiochemical properties of inulin and inulin oligomers[J].Food chemistry,2000,68:179-183

[5]Manzonl M,Cavazzoni V.Hydrolysis of Topinambur(Jerusalem artichoke)fructans by extracellular inulinase of Kluyveromyes marxianus Var.bulgaricus[J].J Chem Technol Biotechnol,1992,54:311-315

[6]陈雄.内切型菊粉酶高活力菌株的筛选[J].湖北农业科学,2003(3):93-94

[7]Arhari R.Purification and characterization of endo-and exo-inulinase[J].Biotechnol Biochem,1999,11:105-107