大鼠局灶性脑缺血再灌注早期血脑屏障通透性变化的研究

王振华，刘云会，马腾，喻博，薛一雪

（中国医科大学1.基础医学院生理学教研室，沈阳110001；2.附属盛京医院神经外科，沈阳110004；3.基础医学院神经生物学教研室，沈阳110001）

缺血性脑血管疾病具有较高的发病率和致死率，严重威胁着人们的健康。缺血的脑组织在治疗中或多或少得以再灌注，使血流再通并降低脑缺血造成的神经细胞伤害，脑缺血再灌注损伤的发生也是困扰临床医生的一个难题［1］。再灌注损伤包括神经细胞代谢紊乱、血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）通透性增加、白细胞浸润等，严重还可引起脑水肿和溶栓后的颅内出血［2］。诸多研究表明BBB结构和功能的改变是缺血再灌注早期一个重要的病理过程，BBB通透性的增加将加重缺血脑组织的损伤［3］。BBB主要由毛细血管内皮细胞、基膜和星形胶质细胞足板组成，是维持中枢神经系统内环境稳定的重要结构。紧密连接相关蛋白claudin-5和occludin在BBB通透性的调节中起着至关重要的作用［4］。近来研究发现脑缺血再灌注损伤中亦伴有蛋白激酶 Cδ（protein kinase C δ，PKCδ）信号通路的激活［5］。为探讨大鼠局灶性脑缺血再灌注早期BBB通透性的动态变化及机制，本研究利用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，检测再灌注2 h内紧密连接蛋白claudin-5，occludin和PKCδ蛋白表达水平的变化及其与BBB通透性变化的关系。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

健康雄性Wistar大鼠96只，体质量（250±10）g，由中国医科大学动物中心提供。随机分成6组：假手术组、缺血1 h组、缺血2 h组、缺血再灌注0.5 h组、缺血再灌注1 h组、缺血再灌注2 h组。claudin-5、occludin和β-actin抗体均购自美国Santa Cruz公司，PKCδ抗体购自美国Bioworld公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠局灶性脑缺血模型制备：参照文献［6，7］，采用大脑中动脉线栓法制作局灶性脑缺血模型。大鼠用10%的水合氯醛（350 mg/kg，i.p.）麻醉后，沿颈前正中部切开皮肤，钝性分离左侧颈动脉鞘，分离出颈内、颈外动脉，结扎翼腭、颈外动脉。将4-0单丝尼龙鱼线自颈总动脉远端切口处向颈内动脉插入约19～22 mm，阻塞大脑中动脉近端血流。假手术组鱼线进入到颈动脉分叉处即可。再灌注时，抽出尼龙线，使血流再通。在手术过程中连续监测动物体温，使其维持在37.0℃。大鼠苏醒后，参照Longa等［8］的方法进行神经功能缺损评分，1～3分的动物可选为实验动物。

1.2.2 BBB通透性的测定：用伊文思蓝（Evans blue，EB）渗透法定量分析BBB通透性变化［9］。制备好缺血模型后，取脑前0.5 h股静脉注射2%EB。到实验组各时间点，麻醉下用肝素化的生理盐水对大鼠进行心脏灌流，当右心房流出的液体变清澈即可断头。将取出的脑组织称重，浸入甲酰胺（1 mL/100 mg），放到60℃水浴箱内孵育24 h。用分光光度计检测波长为620 nm的吸光度，根据绘制的EB标准曲线定量分析染料的含量。

1.2.3 免疫组化：免疫组化方法检测各实验组和对照组脑缺血组织紧密连接蛋白claudin-5和occludin的表达及分布。大鼠用10%的水合氯醛麻醉后，用肝素化的生理盐水进行心脏灌注，然后用4%多聚甲醛灌注，固定好后断头取脑缺血区额顶叶，将标本后固定24 h，依次浸入15%、20%、30%蔗糖溶液中脱水。OCT包埋剂包埋，用冰冻切片机冠状连续切厚度为12 μm的缺血脑组织切片，进行免疫组化染色。claudin-5、occludin的一抗浓度为1∶150，其余常规操作按说明书进行，免疫组化结果用Motic Images Advanced3.2图像分析系统采集图片，测平均光密度值进行claudin-5、occludin表达的定量分析。

1.2.4 Western blot检测：各实验组和对照组迅速断头取脑，提取脑缺血区额顶叶组织加入裂解缓冲液，4℃17000 r/min离心15 min，取上清。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度的定量。各组取等量蛋白上样后，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶粉封闭2 h，将膜分别与1∶500稀释的claudin-5、occludin和PKCδ抗体4℃孵育过夜，室温下与相应二抗孵育2 h，ECL法显色。以β-actin为内对照，所得胶片扫描后，采用Fluor Chen2.0软件进行定量分析，测得各条带的整合光密度值（integrated density value，IDV）。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 BBB通透性的变化

伊文思蓝渗透法结果显示，脑组织中EB的含量在缺血1 h、缺血2 h、再灌注0.5 h、再灌注1 h、再灌注2h 时为0.107 8±0.0101，0.167 9±0.0125，0.216 9±0.020 8，0.298 7±0.0163，0.3163±0.021 6，与假手术组（0.0552±0.0060）比较均显著升高（P<0.01），EB的含量在再灌注2 h时达到峰值。

2.2 claudin-5与occludin的分布和表达

claudin-5和occludin蛋白主要表达在大鼠脑组织微血管内皮细胞中，在假手术组claudin-5和occludin呈强阳性表达，并沿血管内皮连续分布（图1A，1G）。随着缺血和再灌注时间延长，claudin-5在缺血1 h组、缺血2 h组、再灌注0.5 h组、再灌注1 h组、再灌注2h 组表达为0.371 9±0.0153、0.336 9±0.014 6、0.324 4±0.011 6、0.2892±0.013 8、0.2690±0.010 4，与假手术组（0.4405±0.0185）比较显著降低（P<0.01）；occludin在缺血1h组、缺血2h组、再灌注0.5 h组、再灌注1 h组、再灌注2 h组表达为0.3331±0.0135、0.325 7±0.0090、0.3081±0.015 4、0.2954±0.0149、0.2690±0.0121，与假手术组（0.4005±0.009 9）比较显著降低（P<0.01），且 claudin-5 和occludin沿血管呈不连续分布（图1B～1F，1H～1L），以缺血再灌注2 h表达量最低（图1F，1L）。

2.3 claudin-5、occludin和PKCδ蛋白的表达

采用Western blot法进一步证实缺血再灌注损伤早期对claudin-5和occludin蛋白表达的影响，如图2所示，与假手术组比较，claudin-5和occludin蛋白从缺血1 h开始到再灌注2 h这一过程中表达水平均显著下降，在缺血再灌注2 h时下降最为明显（P<0.01）。而PKCδ蛋白表达的趋势则是随着缺血和再灌注时间延长逐渐升高。缺血1 h组、缺血2 h组、再灌注0.5 h组、再灌注1 h组、再灌注2 h组中PKCδ蛋白表达与对照组比较均具有统计学意义（P<0.01），见表1。

3 讨论

本研究利用大鼠局灶性脑缺血模型证明，缺血再灌注损伤早期引起BBB通透性显著增加。随着缺血再灌注时间的延长，BBB的开放程度逐渐增加，屏障作用减弱，在此过程中紧密连接相关蛋白claudin-5和occludin表达显著下调，而PKCδ蛋白表达显著上调。紧密连接相关蛋白及PKCδ蛋白表达变化与BBB通透性下降的时相变化基本一致。

研究表明缺血再灌注损伤与BBB结构和功能的继发性破坏密切相关，BBB屏障功能的减弱及通透性增加可引起严重的血管源性脑水肿和其他并发症［3］。有文献报道大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤早期有效的治疗时间在缺血后3 h之内［10］，而我们以往研究已探讨了缺血2 h后再灌注3 h至120 h期间BBB通透性的变化及机制［7］，目前局灶性脑缺血再灌注2 h以内BBB的开放及紧密连接变化情况研究甚少，故探讨短暂的脑缺血再灌注过程中BBB变化的时程对缺血性脑血管疾病的治疗有一定指导意义。本研究表明在缺血1 h后，BBB的通透性即显著增加，随着再灌注时间的延长，BBB的破坏逐渐加剧，进一步证实了BBB的渗漏参与了早期的缺血再灌注损伤。

紧密连接相关蛋白是维持BBB完整性的重要因素，其结构和功能的破坏将引起BBB通透性增加，甚至脑水肿。其中claudin-5和occludin蛋白是调节物质通过细胞间紧密连接的最关键成分。本研究结果显示在缺血再灌注早期脑微血管内皮细胞中claudin-5、occludin分布连续性和表达量均发生改变，其表达下调的时程与BBB开放的时程基本符合，claudin-5、occludin在缺血1 h后表达即显著下调，一直持续到缺血再灌注2 h。BBB的通透性增加除与紧密连接开放有关之外，还受细胞旁等途径影响，本研究提示缺血再灌注早期BBB的开放可能与紧密连接claudin-5和occludin的表达下调有关。

研究表明PKCδ信号转导通路快速地激活和蛋白表达上调可加重脑缺血再灌注损伤，应用PKCδ特异性抑制剂可显著减弱再灌注时神经细胞的损害。为深入探讨缺血再灌注2 h内BBB开放的机制，我们应用Western blot方法检测脑缺血再灌注组织中PKCδ蛋白的表达。本研究发现在缺血1 h后，PKCδ蛋白表达显著升高，一直持续到再灌注2 h，其上调的变化趋势与BBB开放和紧密连接蛋白表达下降的趋势基本一致，且有文献报道应用PKCδ选择性抑制剂δV1-1可增加紧密连接ZO-1、occludin与细胞骨架之间的联系，减弱对紧密连接屏障的损伤；而PKCδ的激活可显著降低ZO-1和occludin的表达和引起紧密连接的开放［11］，而在血视网膜屏障、血脑脊液屏障等多种内皮细胞也发现PKCδ在紧密连接相关蛋白分布及表达上起重要调节作用。在血脑脊液屏障PKCδ可通过增加MMP-9活性，来降低紧密连接相关蛋白表达，使血脑脊液屏障通透性增加［5，11］。因此我们推测PKCδ通路的激活可能通过降低claudin-5、occludin表达参与脑缺血再灌注早期BBB通透性的增加。我们将在后续的研究中深入探讨PKCδ通路在BBB开放过程中具体的细胞内信号转导机制。

在脑缺血再灌注早期若能有效地减轻BBB的破坏，将缓解再灌注引起的脑组织损伤。本研究证明了脑缺血再灌注早期紧密连接蛋白claudin-5、occludin表达均下降，而PKCδ表达则显著升高，它们3者可能参与了再灌注早期BBB的开放，这为脑缺血再灌注损伤的治疗提供了一定的实验基础。

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