Survivin基因转染对骨髓间充质干细胞体外抗凋亡能力的影响

范红杰，王倩，冯娟，于维东，张强

（中国医科大学1.附属盛京医院神经内科，沈阳110004；2.附属第一医院干诊科，沈阳110001）

骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）作为重要的组织工程种子细胞，具有多分化潜能，有促进造血重建、免疫调节等作用，并且易于接受外源基因的转染和表达［1］。研究表明，BMSCs能重塑受损的神经元通路和改善神经功能缺失，可成为治疗神经系统疾病理想的种子细胞［2］。而单纯的将BMSCs移植入体内后的低成活率使BMSCs的治疗效果不尽如人意。因此，如何减少其移植后凋亡的发生、提高BMSCs在体内的存活率是目前干细胞移植治疗脑缺血亟待解决的问题。存活素（Survivin）是一个近期发现的凋亡抑制蛋白家族成员，是至今发现分子量最小的、作用最强的凋亡抑制因子，且与细胞分裂、增殖等密切相关，有促进细胞转化并且参与细胞的有丝分裂、血管生成等作用［3］。本实验旨在研究Survivin基因修饰的BMSCs在离体微环境中能否延长其生存能力并探讨其机制，为新的干细胞抗凋亡移植策略提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM低糖型细胞培养基，购自美国Gibco BRL公司；0.25%EDTA胰蛋白酶，购自美国Sigma公司；胎牛血清，购自美国 Gibco公司；PBS（pH7.2）、TRIZOL（Invitrogen公司）、反转录试剂盒，购自美国Promege公司；PCR相关试剂、限制性内切酶、胶回收试剂盒、T4DNA连接酶、质粒提取试剂盒、琼脂糖，均由日本TaKaRa公司提供；Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒，购自碧云天生物技术研究所。实验动物为6～8周龄、体质量100～150 g的清洁级雄性SD大鼠10只，由中国医科大学动物实验中心提供，动物使用许可证号为SYXK（辽）2008-0005。

1.2 方法

1.2.1 大鼠BMSCs的分离和培养：取6～8周龄SD大鼠颈椎脱臼法处死，钝性分离肌肉组织，完全暴露股骨和胫骨。从股骨和胫骨连接处小心分离，用止血钳夹住股骨末端轻轻旋转外拉取出股骨，立即置于装有20 mL无血清低糖DMEM培养基的小烧杯中。依次取出另一侧股骨和两侧的胫骨，剪去骨头两端的软骨，抽取含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基5 mL，将针头插入骨髓腔反复冲洗，弃上清，用5 mL新鲜培养基重悬细胞，转移至25 mL培养瓶中，置细胞培养箱中培养。约24 h换液去除悬浮生长的细胞和死细胞，继续培养，每3 d换液1次，并弃掉未贴壁细胞，每日观察细胞生长状况，待细胞融合至80%～90%开始传代，标记至P3代。分为3组：MSC组（正常血清培养）、BMSC组（无血清培养48 h）和BMSC-Survivin组（无血清培养48 h）。

1.2.2 真核表达载体质粒转染：收获处于对数生长期的BMSCs，以5×104/孔转种于6孔培养板中，37℃、5%CO2环境中培养24 h，细胞长至80%融合。转染率的测定通过流式细胞仪检测并分析未转染组、转染空质粒组和转染Survivin基因组的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表达率。

1.2.3 RT-PCR检测Survivin基因表达情况：应用Primer3设计引物，以待检测细胞的cDNA为模板，引 物 为 ：5′-ACCGCATCTACACCTTCAA-3′和5′-AGTGCTTCCTATGCTCCT CTAT-3′，扩增长度192 bp；内参基因β-actin引物序列为5′-GTTGCGTTAC ACCCTTTCTT-3′和5′-CGAAGGCTCATCATTCAAA A-3′，扩增长度443 bp，由北京三博远志生物工程服务有限公司合成。PCR反应条件：94℃预变性5 min，然后按 94 ℃30 s、59 ℃30 s、72 ℃ 45 s进行35个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物取10 μL加2 μL 6×上样缓冲液，电泳，紫外成像仪获取图像，软件分析。

1.2.4 BMSCs对去血清凋亡的检测：待检测的细胞及对照细胞倒掉培养液，PBS洗后用0.25%胰酶消化1.5 min，倒掉胰酶，PBS小心洗1次，用PBS吹打1 min成细胞悬液，吸入Appendorf管，4℃、1000 r/min离心1 min，然后PBS重悬，4℃、1000 r/min离心2次，以PBS重悬后调整细胞密度至5×106/mL，加入10 mL AnnexinⅤ混匀，室温暗处温育染色15 min，在上机前5 min加入10 mg/L碘化丙锭（propidium iodide，PI）染液5 mL。用FACS流式细胞仪进行双色荧光细胞流式计数，观察凋亡细胞百分比。分为3组：未转染组、转染空质粒组和转染Survivin基因组。

1.3 统计学分析

采用SPSS13.0统计软件，应用方差分析或成组t检验进行组间比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSCs的形态学观察

接种初始的BMSCs为圆形，散在分布。48 h后细胞基本贴壁，并且有集落形成，进行第1次换液。换液后清除悬浮细胞，BMSCs开始贴壁生长，第7天左右细胞可铺满瓶底。传代后随着培养时间延长，贴壁细胞迅速增多，呈细长状有突起为漩涡状生长，其间分布有散在黑色颗粒可能为黏附性强的血细胞，胰蛋白酶消化传代后逐渐消失，第3代时可见细胞以梭形为主。

2.2 流式细胞仪分析细胞的转染率

未转染组、转染空质粒组和转染Survivin基因组细胞的GFP表达率分别为1.3%、35.3%和32.8%（图1）。

2.3 RT-PCR检测Survivin基因表达结果

Survivin/β-actin比 值 MSC 组 、BMSC 组 和BMSC-Survivin 组分别为1.17、1.13 和1.75，Survivin基因表达量BMSC-Survivin组较MSC组和BMSC组明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），MSC组和BMSC组比较差异无统计学意义（P>0.05），见图2。

2.4 Survivin基因转染对BMSC细胞凋亡的影响

去血清培养后BMSC组的早期凋亡率（2.84%）较 MSC 组（2.45%）升高（P<0.05）；血清培养 48 h后，BMSC-Survivin组（0.89%）较BMSC组的早期凋亡率降低（P<0.05），见图3。

3 讨论

关于BMSCs的研究已成为国内外研究的热点，BMSCs具有来源广泛、取材方便、体外分离和扩增简便等优点，自体移植无免疫排斥反应，避开了伦理学争议，具有广阔的临床应用前景。BMSCs能转染和长期表达外源性基因，近期已从单纯的BMSCs移植发展到经处理后再移植。但是BMSCs有其局限性，由于在体存活时间短，使其促进血管再生成、分泌营养因子等作用并不显著，所以减少BMSCs的凋亡率是充分发挥干细胞潜能的关键。Survivin是一种凋亡抑制基因，Survivin在肿瘤组织中高表达，在分化成熟的正常组织中不表达［4］，可作用于细胞周期的G2/M期，与细胞分裂、增殖等密切相关，有促进细胞转化并且参与细胞的有丝分裂、血管生成等作用［5］。因此，本实验选择Survivin作为外源基因，通过脂质体将其转染至BMSCs，旨在发挥Survivin基因的抗凋亡作用，延长BMSCs的生存时间，使细胞治疗与基因治疗相结合，充分发挥治疗作用。

本实验采用国内外主流的Annexin V/PI方法检测凋亡早期细胞。细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别难度较大。Annexin V是一种钙离子依赖的磷脂结合蛋白，具有易于结合到磷脂类如磷脂酰丝氨酸的特性，对磷脂酰丝氨酸有高度的亲和性，因此该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸［6］。磷脂酰丝氨酸转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就已破坏。PI是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞中，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染［7］。因此，本实验将Annexin-V与PI匹配使用，建立一种用Annexin V在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合PI染料排除试验，以区分凋亡早晚期的细胞以及死细胞。

实验研究结果显示，Survivin基因转染后可降低大鼠BMSCs去血清培养后的早期凋亡率，使细胞存活时间延长。但是，其确切的机制有待于进一步的研究和证实。目前认为，Survivin抗凋亡作用的机制可能为：（1）直接抑制细胞凋亡蛋白酶导致细胞凋亡通路受阻而起到抑制凋亡的作用，这是由于它含有的BIR2功能区，可在Bcl-2的下游与caspase-3和caspase-7结合而直接抑制其活性；（2）通过抑制位于染色体同一基因簇并且编码序列广泛互补的效应细胞蛋白酶受体1转录，上调Survivin，从而减少细胞的凋亡，即Survivin与效应细胞蛋白酶受体1相互作用来调节细胞的凋亡；（3）抑制细胞色素C和caspase-8诱导的caspase的激活，发挥抑制细胞凋亡的作用；（4）与细胞周期调节因子CDK4结合，形成Survivin/CDK4复合物，该复合物使p21被释放，从而使CDK4与Procaspase相互作用抑制细胞凋亡［8，9］。

此外，Liu等［10］的研究显示转染后的干细胞可能是由于提高干细胞的存活率和上调VEGF和bFGF保护因子的分泌来达到治疗作用的，而VEGF和bFGF保护因子的升高可能是BMSCs生存时间提高的结果。如何提高治疗作用的关键在于如何提高干细胞的生存时间，所以Survivin提高干细胞的生存时间是今后研究的重要方向，其机制需要再进一步的研究，使转基因治疗缺血性脑血管病以及其他器官疾病的治疗成为可能。同时本实验也存在一些不足之处：（1）没有充分的证据证明BMSCs转染后的多分化性和保护因子的高分泌，需要下一步的实验及体内实验继续研究；（2）Survivin基因转染后增强BMSCs抗凋亡能力的确切机制仍不明确，有待于进一步研究和探讨。

总之，本实验结果提示转染Survivin基因对BMSCs具有保护作用，可降低去血清培养的早期凋亡率，延长其存活时间，使解决BMSCs在体内凋亡率高的问题有了新的突破，从而为临床治疗提供了一个新的思路。

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