MultiSite Gateway技术在疟原虫条件性基因打靶载体快速构建中的应用

王各各，李娇娜，杜峰，邓舒，梁佳元，曹雅明，罗恩杰

（1.中国医科大学基础医学院免疫学教研室，沈阳110001；2.沈阳市中医药学校基础教研室，沈阳110001；3.中国医科大学基础医学院病原生物学教研室，沈阳110001）

疟疾作为一种严重威胁人类生命健康的感染性寄生原虫疾病，据2011年WHO报告，2010年全球约33亿人受到疟疾的威胁，导致约65.5万患者死亡［1］，给全球尤其是发展中国家带来了严重的健康危害和经济负担。由于疟原虫和传播蚊虫的耐药问题［1，2］及目前尚无有效的疟疾疫苗［3］，所以疟疾的防治工作形势仍然十分严峻。而随着各种疟原虫基因序列相继公布，基因修饰技术（genetic modification technologies）广泛地应用于疟原虫基因功能的研究，疟原虫生物学行为及其与宿主的关系等方面的研究，为抗疟疫苗的研制和疟原虫耐药机制研究开创了新途径。对基因操纵的过程是一个繁琐又漫长的过程，除了源于转染效率较低外，还在于构建一个富含AT序列的打靶载体也很费时［4］。而MultiSite Gateway技术（MultiSite Gateway technology）为构建含有这样序列的打靶载体提供了快速方便的方法。MultiSite Gateway克隆技术的基础是lambda噬菌体的位点特异性重组反应，是一种准确保存遗传信息的有效的自然生化途径。本方法可以使DNA片段在含有重组位点的两质粒间进行定向置换，也可以用含有重组位点的DNA片段置换相应质粒上的片段。与传统的需要DNA限制性内切酶、DNA连接酶、凝胶电泳和DNA片段纯化等多个步骤的单调乏味的亚克隆方法相比，该方法操作方便、快捷，节省了大量的时间和劳力。本文以构建约氏疟原虫红细胞结合样蛋白（erythrocytebinding-likeprotein，ebl）［5］，条件性敲除基因打靶载体为例，展示该方法的实施策略、操作过程及其优越性。

1 材料与方法

1.1 材料

约氏疟原虫致死型（P.yoelii17xl）、质粒pCHD43 （Calmodulin5′driving hDHFR，referring to the orientation of the att cassette and 4/3 for attR sites 4 and3，前期构建包括药物筛选基因hDHFR和基因重复reg20序列等元件）和P.bUIS4/flp［6］由长崎大学热带医学研究所提供，E.coliJM109和DH5α由本教研室保存。

1.2 方法

1.2.1 质粒pCHD-EBL-FRT的构建

主要应用MultiSite Gateway方法，完成若干DNA片段的定性重组。MultiSite Gateway方法主要包括BP反应（BP recombination reaction）和LR反应（LR recombination reaction）。BP反应，以attB为基础（attB PCR产物或是表达克隆）与attP（供体）反应后建立1个包含attL的PENT克隆。LR反应，1个包含attL的PENT克隆与1个包含attR的目的载体反应后建立一个包括attB的表达克隆。

1.2.1.1 获取EBL基因同源臂

1.2.1.1.1 PCR获取3′同源臂

以P.y17xl株基因组为模板，用分别含有F3序列、attB4位点和 SpeⅠ酶切位点、attB1位点的yEBL3UF3B4F和yEBL3USpe B1R引物（表1）扩增3′同源臂F3-EBL3U。PCR条件为94℃2 min；98℃10 s，65 ℃30 s，68 ℃30 s，35 cys；68 ℃ 7 min。在此我们使用由FRT序列修饰而来的F3序列，代替FRT，从而防止与PyUIS4/flp质粒单交叉法插入基因组（达到条件表达flp酶的目的）后所保留的FRT位点之间发生位点特异的重组。

1.2.1.1.25′同源臂的获取及pB12F3-EBL5U.orf质粒的构建

引物 FRT-F3 PstF、FRT-F3 BamR（表1）经 92 ℃变形72℃退火得F3片段，并把此片段连接到PstI，BamHⅠ酶切的pB12-2质粒上得质粒pB12F3。以P.y17xl基因组为模板，用引物yEBL5U1SpeF和yEBL5U1R（见表1）PCR 扩增EBL.5U1（577bp）片段，条件为 94 ℃2min，98℃10 s，55 ℃30 s，68 ℃1min，35 cys；68℃7 min。用一步酶切连接法完成EBL.5U1片段和PB12F3质粒的酶切和连接反应，反应体系内同时加入StuI酶和T4连接酶，经16℃2 h，25 ℃1h，6cys；65 ℃10 min；25 ℃过夜完成反应。连接质粒（PB12F3-EBL5U1）转化DH5α细胞。用菌落PCR鉴定后再以引物M13F/M13R测序验证。应用同样步骤将PCR扩增的EBL-5U2+EBL.orf（3285 bp）序列（引物yEBL5U2F和yEBLorf R；条件94℃2 min；98 ℃10 s，52 ℃30 s，68 ℃2min，35 cys；68 ℃7 min），以SmaI酶切位点的一步酶切连接法构建质粒pB12F3-EBL5U.orf，随之转化、菌落PCR和测序鉴定。

1.2.1.2 BP反应获取含有同源臂的Entry载体

PCR产物F3-EBL3U与载体pDonrP4P1R进行BP反应构建质粒pENT41F3-EBL3U。pB12F3-EBL5U.orf与pDonr221进行BP反应构建Entry载体pENT12F3-EBL5Uorf。以上反应均按Invitrogen说明书操作步骤进行。

同时构建1个含有Myc标签的质粒pENT23-6Mycs。可使置换的ebl基因C端附有Myc标签，方便ebl表达监测。

1.2.1.3 LR反应及多基因片段的组装

将3个 Entry载 体 pENT41F3-EBL3U、pENT12F3-EBL5Uorf和pENT23-6Mycs与pCHD43进行LR反应，得到目的质粒pCHD-EBL-FRT（总体构建过程见图1）。LR反应按Invitrogen说明书进行操作。随后进行转化，筛选阳性克隆，所提质粒用SpeⅠ、PstⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定。

1.2.2 P.yUIS4/flp质粒的构建

1.2.2.1 同源臂的获取

以P.y17xl株基因组为模板，PCR扩增uis4基因的5′非翻译端作为同源臂片段（PyUIS4-5U）。并通过AT克隆构建含有PyUIS4-5U片段的质粒PGEM-T-PyUIS4-5U。通过位点特异突变（所用引物为表中yUIS4-5U.NhAv2R和yUIS4-5U.NhAv2F），使质粒PGEM-T-PyUIS4-5U的PyUIS4-5U区段含有AvrⅡ和NheⅠ两种酶切位点作为线性化位点。

1.2.2.2 同源臂的置换

用含有AvrⅡ和NheⅠ酶切位点PyUIS4-5U片段置换质粒PbUIS4/flp同源臂（PbUIS4-5U），得约氏疟原虫插入质粒PyUIS4/flp。经SmaⅠ和NcoⅠ酶切、凝胶电泳、回收、连接等多步亚克隆完成。

2 结果

2.1 同源臂序列的测序验证

质粒 pENT41F3-EBL3U、PB12F3-EBL5U1、pB12F3-EBL5U.orf和pGEM-T-PyUIS4-5U经测序显示同源臂序列与预期结果一致。

2.2 质粒酶切鉴定

2.2.1 质粒pCHD-EBL-FRT酶切鉴定：质粒pCHDEBL-FRT经SpeⅠ酶切后产生一个11.3 kb的片段；经PstⅠ酶切后产生两个片段，分别为4.6 kb和6.7 kb；经EcoRⅠ酶切后产生3个片段，分别为2.4 kb、3.6 kb和5.2 kb，均与预期结果完全一致（图2）。

2.2.1 质粒PyUIS4/flp酶切鉴定：质粒PyUIS4/flp经NheⅠ酶切后产生一个8 kb的片段；经PstⅠ酶切后产生两个片段，分别为2.2 kb和5.7 kb；经XhoⅠ酶切后也产出两个片段，分别为1.6 kb和6.1 kb，均与预期结果完全一致（图3）。

3 讨论

随着反向基因技术（reverse genetic technologies）广泛地用于疟原虫基因功能的研究，如何快速有效地构建基因打靶载体越来越引起人们的重视。一个完整的传统型基因打靶载体一般包括：基因组同源区长、短臂，可进行原核及真核筛选的标记基因，以及打靶质粒骨架等组成部分；条件性基因敲除打靶载体除了以上的组成部分外，还需连接两侧附带loxP或FRT位点的打靶序列。目前比较常用的基因打靶载体构建方法是：先通过PCR扩增各组分，然后再分别进行酶切、连接和转化筛选。运用这种方法，即便是最普通的传统型基因敲除打靶载体也需要至少3次酶切、连接和转化反应［7］。不仅操作相对烦琐，而且多次的体外酶切与连接反应还增加了DNA突变的危险。

由于疟原虫基因组AT含量较高，使其打靶载体含有富集AT的基因片段，加之打靶载体一般较大（10 kb以上），导致打靶载体在大肠杆菌内的拷贝数较少并且固有的稳定性降低［4］。因此相对其他真核细胞打靶载体构建，疟原虫打靶载体的构建更费时费力。而MultiSite Gateway技术不需要酶切和连接反应，并且BP和LR反应比传统的连接反应有更高的效率和特异性，还可同时进行多个相互独立的位点特异的重组反应，一步即可组装4段基因片段（1段质粒骨干区和3段插入序列，如图1所示），完成质粒的构建。比传统打靶载体构建省时省力。同时考虑可用于筛选基因修饰疟原虫的耐药基因较少的情况［8，9］，把耐药基因加入质粒 pCHD43 内，作为质粒骨干区与同源臂进行组装，进一步优化了质粒的构建。3步即可完成疟原虫打靶载体的构建：（Ⅰ）PCR获取相应基因的同源臂；（Ⅱ）BP重组反应得PENT克隆；（Ⅲ）通过LR重组反应一步完成多DNA片段的组装。需要注意的是在第一步PCR获取同源臂时，应考虑后续的BP和LR反应及构建打靶载体的类型设计含有相应attB位点和线性化酶切位点的引物，例如用于本实验的5′同源臂的上游和下游引物应分别含有attB4和attB1序列等。再次本实验在构建5′同源臂PENT克隆时，我们使用传统质粒构建方法分段分步完成质粒的构建，克服由较长的富含AT重复序列的5′同源臂及要加入speⅠ和F3序列所带来的困难。由此我们看出，对于同源臂PENT克隆的构建应根据实验的具体情况一步BP反应完成（如本实验3′同源臂PENT克隆载体的构建）或结合其他方法分步完成（如本实验5′同源臂PENT克隆载体的构建）。

总之，从总体操作来看，以MultiSite gateway技术为基础的体系可作为高效打靶载体的构建工具，提高基因打靶技术研究疟原虫基因功能的效率。继而我们将通过单交叉法，将PyUIS4/flp插入到UIS4基因5′非翻译区，使flp酶能在子孢子期表达，为条件敲除目的基因提供基础。再通过双交叉法，用质粒pCHD-EBL-FRT中含有F3序列的ebl基因置换原基因组ebl区段，从而达到条件敲除ebl基因的目的。最终为疟原虫与宿主的关系及减毒活疫苗的研究奠定基础。

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