氟对大鼠MDA和GSH－Px基因表达的影响＊

刘 连，徐园园，许 洁，黄厚今

(1．遵义医学院组织学与胚胎学教研室，贵州 遵义 563099;2．山东省眼科研究所病理科，山东 青岛266071;3．遵义医学院预防医学教研室，贵州 遵义 563099)

氟是人体生命所需的微量元素，但过量摄入氟，对机体又有强烈的毒性作用，正常情况下，由于机体内存在氧化－抗氧化系统，维持内环境的稳定，其中，抗氧化系统中的各种抗氧化酶，如谷胱甘肽过氧化物酶(GSH－Px)、超氧化物歧化酶(SOD)的存在，可将过量产生的自由基及时清除［1，2］。但有关氟中毒发病机制中 GSH －Px的研究，多数研究为对其进行活性检测，本实验拟从分子水平上，研究大鼠肝组织中GSH－Px的mRNA表达，并检测大鼠肝组织中MDA的含量、GSH－Px的活性，探讨其在氟中毒的发病机制中的相互关系及其作用。

1 材料与方法

1．1 实验动物分组及处理 清洁级3周龄SD大鼠32只(中国人民解放军第三军医大学第三附属医院)。根据大鼠体重随机分为4组，每组8只，雌雄各半，在本院实验动物室饲养。对照组大鼠每天定时以去离子水灌胃，实验组大鼠每天定时分别给予含NaF(分析纯)10，20，40 mg/kg的去离子水灌胃。分别于1个月后处死;①处死大鼠前，将大鼠放入事先泡酸处理过的代谢笼，留取24 h尿液，装入具塞聚乙烯管中，保存于－35℃冰柜中，两周内完成测定;②采集血液标本:置于具塞聚乙烯管中，立即离心 6000 r/min，10 min，取血清，保存于－35℃冰柜中，待测血氟浓度;③肝脏组织制备:制成10%的组织匀浆，分别保存于－35℃及－80℃冰柜中，待测 MDA含量、GSH－Px的活性及GSH－Px的mRNA的表达。

1．2 方法

1．2．1 参照《血清中氟化物的测定－离子选择电极法标准(WS/T 212－2001)》检测血氟浓度。

1．2．2 参照《尿中氟化物测定－离子选择电极法标准(WS/T 89－1996)》检测尿氟浓度。

1．2．3 MDA采用硫代巴比妥酸(TAB)法检测，GSH－Px活性采用二硫代二硝基苯甲酸法测定，检测试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。

1．2．4 GSH－Px的mRNA表达采用实时荧光定量PCR(Real Time PCR)技术进行检测，SYBRPrimeScriptTMRT－PCR Kit试剂盒购于TaKaRa公司。用于扩增GSH－Px的mRNA的引物序列为:上游:5’－CCGGGACTACACCGAAATGAA －3’，下游:5’－CACCGGGTCGGACATACTTG－3’，扩增产物长度为882bp。参照物为β－actin:上游引物为5’－ACCAACTGGGACGATATGGA－3’，下游引物为5－CAGTGAGGCCAGGATAGAGC－3’，扩增产物长度为819 bp。40个循环。

1．3 统计学分析 用SPSS10.0统计分析软件，各组数据用软件方差分析，结果以均数±标准差(x±s)表示，并作方差分析。

2 结果

各组大鼠血氟、尿氟含量、肝组织MDA、GSH－Px的活性及其mRNA的表达(见表1)。

随染氟剂量的增加，1月后各剂量组大鼠血氟浓度相应增加，存在剂量－效应关系(r=0.884，P＜0.01)，但各剂量组间血氟浓度无统计学意义;各剂量组大鼠尿氟浓度相应增加，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，存在剂量－效应关系(r=0.921，P＜0.01)，差异有统计学意义;各剂量组大鼠肝组织MDA含量升高，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，存在剂量 －效应关系(r=0.797，P＜0.01)，差异有统计学意义;各剂量组大鼠肝组织GSH－Px的活性下降，与对照组比较有统计学意义(P＜0.01)，存在剂量－效应关系(r=－0.912，P＜0.01)，差异有统计学意义;各剂量组大鼠肝组织GSH－Px的mRNA表达下降，与对照组比较有统计学意义(P＜0.01)，存在剂量 －效应关系(r= －0.909，P＜0.01)，差异有统计学意义。

表1 各组大鼠血氟、尿氟含量，肝组织中MDA、GSH－Px的活性及其mRNA的表达(x ± s，n=8)

3 讨论

血氟、尿氟水平的高低是直接反应机体以外环境摄入氟含量多少的客观指标［3，4］。本实验中，血氟及尿氟的浓度均随摄入氟化钠的量变化而变化，且血氟、尿氟浓度同饮水氟浓度间有具有良好的线性关系。该结果很好地显示了，随染氟剂量的增加，大鼠体内的氟负荷也在相应增加。

目前已公认GSH－Px在细胞内能清除过氧化物代谢产物，阻断脂质过氧化的链锁反应，从而起到保护细胞膜结构和功能完整的作用［5］。因此，GSH－Px活性的高低可间接反映机体清除氧自由基的能力，而本实验不仅检测到肝组织中GSHPx的活性下降，还从分子水平的基础上检测到肝组织中GSH－Px的mRNA的表达也相应降低。提示随染氟浓度的增高，机体内清除氧自由基的能力也在相应降低，也就是说机体内的抗氧化系统失衡，将导致自由基在体内大量堆积，脂质过氧化反应增强，其产物 MDA会增加。因此，MDA含量的高低间接反映了机体受自由基攻击的严重程度［6，7］。而本实验中，各剂量组大鼠肝组织 MDA含量升高，并存在剂量－效应关系，提示随染氟剂量的增高，机体受自由基攻击的程度也越严重，脂质过氧化反应加重。

以上结果提示，氟中毒的发病机制可能是氟中毒引起了机体内自由基的大量增多，导致机体抗氧化系统失衡，即GSH－Px活性及其mRNA的表达也相应降低，脂质过氧化反应加重，因此，其产物MDA也会相应增加。

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