miRNA－7在小鼠不同组织器官中表达的检测及其意义＊

郑 静，李 颖，秦安东，秦娜琳，罗军敏，徐 林

(遵义医学院免疫学教研室暨贵州省免疫学研究生教育创新基地，贵州 遵义 563099)

微小RNA(microRNAs，miRNAs)是近年来新发现的一类非编码小分子RNA，通过与靶mRNA的3'UTR结合而导致mRNA的降解或蛋白质翻译的抑制从而下调基因的表达［1］。

已有的研究显示miRNAs在机体组织器官中的表达具有和多样性及时序性，在组织器官的发育、分化过程中均发挥重要作用［2－4］，且是多种疾病发生发展的重要调控分子。miRNA－7是新近报道的miRNAs家族成员，已有的研究发现，miRNA－7为胰岛内分泌部表达水平最高的miRNA家族分子［5］;进一步的研究显示，在8～22周的胎儿胰腺组织中，miRNA－7表达水平与胰岛内分泌激素的指数增长期密切相关［6］，并且在小鼠胚胎发育早期沉默miRNA－7可导致胰岛素分泌显著降低、胰岛β细胞的发育障碍及凋亡［7］。这些研究结果提示，miRNA－7可能在机体组织器官发育中发挥了重要的生物学作用。因此，深入研究miRNA－7在机体组织器官中的表达必将为后续最终阐明其生物学功能提供重要帮助。

本研究旨在利用Real－time PCR探针检测方法检测小鼠12种不同组织器官中miRNA－7的相对表达水平，为后续探讨miRNA－7与各器官的发育、分化、功能维持及疾病发生之间的关系及其机制提供前期实验依据。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1标本 SPF级6～8周雌性BALB/c小鼠，购自第三军医大学实验动物中心。

1．1．2仪器及试剂 LEGEND MICRO 21R型低温离心机(美国Thermo);S1000 ThermalTM Cycler(美国BIO－RAD);iCycler iQTM Real－Time PCR Detection System(美国 BIO－RAD)RNAiso Plus(日本TaKaRa);RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas);SYBR Premix Ex Taq(日本 TaKa-Ra);TaqMan(r)Small RNA Assay(美国ABI)。

1．2 方法

1．2．1 小鼠12器官总RNA提取 采取颈椎脱臼方法处死小鼠，取脑、肝脏、小肠、皮肤、肺、心脏、肌肉、肾脏、骨、胸腺、脾脏、淋巴结，每50 mg组织加入1 mL RNAiso Plus，匀浆器研磨，每1 mL匀浆液加入200μl三氯甲烷，离心剧烈震荡15 S，室温静置5 min，12000 rmp离心15 min，移取上清液入新离心管，上清液中加入等体积异丙醇，静置10 min，12000 rmp离心10 min，可见管底沉淀，弃去上清，70%乙醇洗涤沉淀2次，干燥沉淀，加入30 μlRas efree water溶解沉淀。

1．2．2 总RNA逆转录成cDNA 内参基因GAPDH逆转录反应体系及条件按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书操作，RNA 15 μl，oligo(dT)primer 2 μl，DEPC treated water 7 μl，70℃ 5 min 降至 4℃;5 × reaction buffer 8 μl，10mMdNTP mix 4 μl，Ribolock Rnase inhibiter 2 μl，37℃ 5 min降至 4℃;Re－Transcriptase 2 μl，42℃1 h降至4℃。设计miRNA－7特异性逆转录引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGG ATACGACACAACAA(下划线部分为茎环结构，设计原理如图1A)，逆转录反应体系及条件:RNA 5 μl，RT primer 3 μl，DEPC treated water 2．06 μl，5 × reaction buffer 3 μl，10mMdNTP mix 1．5 μl，Ribolock Rnase inhibiter 0．19 μl，Re － Transcriptase 0．25μl，16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5min 降至4℃。

1．2．3 Real－time PCR检测 miRNA －7表达水平根据文献报道［8］，利用 iCycler iQTM Real－ Time PCR Detection System对miRNA－7的表达进行定量分析。小鼠内参基因GAPDH引物由上海生工合成，上游:5＇GGTGAAGGTCGGAGT CAACG 3＇，下游引物:5＇CAAAGTTGTCATGG ATGHACC 3＇。内参基因GAPDH Real－time PCR反应体系及条件按照SYBR Premix Ex Taq说明书操作:2×SYBR(r)Premix Ex TaqTM 10 μl，dH2O 8 μl，cDNA 1μl，PCR Forward Primer(10μM)0．5 μl，PCR Reverse Primer(10 μM)0．5μl，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃1 min，84℃采集荧光信号，55℃至95℃，每升高0．2℃采集一次荧光，绘制溶解曲线以确定扩增产物的特异性;针对miRNA－7 cDNA设计合成上、下游引物及Taqman探针(图1B)，Real－time PCR反应体系及条件:20×TaqMan(r)Small RNA Assay 1 μl，cDNA 1 μl，2 × TaqMan(r)Universal PCR Master Mix II 10μl，dH2O 6μl，95℃ 10min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，60℃采集荧光信号。所得数据采用2－Δct法分析。

1．3 统计方法 所有实验均重复3次，数据采用SPSS16.0软件进行分析，数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 应用 Real－time PCR探针法成功检测miRNA－7的表达 我们首先根据miRNA－7的结构，设计 miRNA－7特异性逆转录引物。将BALB/c小鼠胸腺细胞中抽提的 RNAs，经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性及纯度，28 S约为18 S亮度两倍，符合下一步实验要求(见图2 A)，定量后进行逆转录，然后利用miRNA－7特异性探针对不同稀释度的逆转录模板进行Real－time PCR反应并绘制标准曲线(模板稀释比例分别为:1:1;1:5;1:25;1:125;1:625)(见图2B，2C，2D)。该方法可以检测到不同稀释度的miRNA－7水平，R＞0.98。

图1 Real－time PCR检测miRNA－7表达水平

图2 Real－time PCR探针法检测miRNA－7的表达

2．2 小鼠12种组织器官中miRNA－7的表达我们检测了小鼠骨组织、心、胸腺、脾脏、肺、肝、淋巴结、皮肤、小肠、肾、肌组织、脑等12种组织器官中内参基因GAPDH的表达(见图3A)及miRNA－7的表达(见图4A)，经融解曲线分析(见图3B)及琼脂糖凝胶电泳鉴定，成功扩增GAPDH约500bp特异性片段(见图3C)及miRNA－7约60bp特异性片段(见图4B)。以GAPDH为内参，分析miRNA－7在以上组织器官中的相对表达水平(见表1，表2，图5)。miRNA－7在这些组织器官中均存在表达，其在淋巴结中表达水平最低，而在肺组织中表达水平最高，在脑、小肠、胸腺、脾脏中表达水平也较高(P＜0.05)。

图4 小鼠12种组织器官中miRNA－7的表达

表1 小鼠12种组织器官中miRNA－7的相对表达量数据(x±s)

图5 小鼠12种组织器官中miRNA－7相对表达水平(P＜0．05)

3 讨论

目前对于miRNAs最常用的检测手段包括Northern blotting、Microarray及 Real－time PCR 等。其中 Real－time PCR［8］检测方法具有所需样本量小、敏感度高、特异性强、耗时短及能够区分成熟体与前体等优点。本研究利用miRNAs分子成熟体的结构特点，成功设计miRNA－7特异性茎环结构逆转录引物，应用Real－time PCR扩增miRNA－7成熟体。并且，我们的检测结果显示:miRNA－7在小鼠多种组织器官中均表达，如脑、小肠、胸腺等。相似的，有研究者发现在人脑中miRNA－7的表达水平较高，与神经元的发育密切相关，且miRNA－7也参与了帕金森病的发生过程，推测其机制与miRNA－7可下调α－突触核蛋白的表达水平有关［9］。还有研究发现，miRNA－7可通过下调真核翻译起始因子EIF5A及膜联蛋白A4来抑制神经胶质瘤的侵袭［10］。此外，在胚胎干细胞的皮层发育、神经元分化过程，miRNA－7的表达水平显著偏高，并调控神经轴的生长［11］。以上研究及我们的结果均提示miRNA－7可能在脑组织的正常发育及脑部相关疾病的发生中起到重要作用。

现有的研究表明，肺癌中miRNA－7的表达水平较正常肺组织显著降低。我们在前期研究中也发现miRNA－7可抑制人肺癌细胞的体外生长，其机制可能与miRNA－7下调EGFR表达有关［12］。新近的研究还报道miRNA－7也可通过下调BCL－2来诱导肺癌细胞的凋亡［13］。结合到本研究发现的miRNA－7在肺组织的高表达，我们推测，miRNA－7是参与肺正常功能维持及调节肺脏肿瘤发生的重要调节因子之一。有研究显示miRNA－7在果蝇眼感光细胞的发育分化过程与其靶分子EGFR形成负反馈回路从而参与调控了果蝇眼的发育过程［14］;并且，EGFR在胸腺表皮细胞及胸腺瘤细胞中的表达水平显著低于 恶性胸腺瘤，提示EGFR的正常表达水平在胸腺正常生理状态及功能维持中可能发挥重要作用［15］;另外，EGFR可促进肠上皮细胞的再生，并与肠上皮细胞癌的发生相关［16］。结合本研究中发现的 miRNA－7在肠、胸腺、脾脏中存在高表达，提示miRNA－7可能通过调控EGFR等靶分子的方式在上述器官的发育、分化、功能维持及疾病发生中发挥关键作用。此外，我们还发现miRNA－7在淋巴结肿的表达水平最低，而在胸腺中表达水平较高。现已知，胸腺为T细胞发育分化的场所，而淋巴结为T细胞外周定居的器官，两者miRNA－7表达水平的差异提示miRNA－7可能参与了胸腺中T细胞的发育分化过程，然而其具体的作用及机制仍有待后续阐明。

总之，本研究成功利用Real－time PCR技术检测了miRNA－7在小鼠12种不同组织器官中的表达谱，这为后续进一步探讨miRNA－7的生物学功能及其作用机制提供了前期实验基础。

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