穿孔素和颗粒溶素在多发性肌炎和皮肌炎中的表达

李 志，张梦莹，宣 丹，毛桐俊，陆进明，徐 亮

(皖南医学院附属弋矶山医院 风湿免疫科，安徽 芜湖 241001)

特发性炎性肌病(IIM)是一组主要以四肢近端肌肉及颈、咽部肌肉受累为主的结缔组织疾病。多发性肌炎(PM)和皮肌炎(DM)是IIM最常见的两种类型。近年穿孔素(perforin)和颗粒溶素(granulysin)在炎性肌病的研究日趋增多。本文通过检查患者血清穿孔素和颗粒溶素在炎性肌病的表达从而探讨两者在炎性肌病血清中表达的差异。

1 对象和方法

1.1 对象与分组 选取2010年2月～2011年2月我院收治的初发PM和DM 20例，均符合诊断标准［1］。其中PM 8例，男性2例，女性6例，平均年龄(47.25±7.36)岁;DM 12例，男性5例，女性7例，平均年龄(47.08±11.28)岁，初发类风湿关节炎10例，男性4 例，女性 6 例，平均年龄(45.70 ±14.50)岁，正常对照组8例，男性4例、女性4例，平均年龄(48.50±10.52)岁。在PM和DM组进行比较时，DM组选取10例。将PM和DM整体作为炎性肌病组(20例)与对照组及类风湿关节炎组进行两两比较，判断穿孔素和颗粒溶素在以上组间的差异。

1.2 方法 PM/DM患者、类风湿关节炎患者和对照组均清晨空腹取静脉血3 ml，分离血清于－20℃冰箱冷冻保存备用。肌酸激酶、肌酸激酶同工酶等由临床检验科室以免疫比浊法测定完成。血清穿孔素和颗粒溶素的测定，按所购买ELISA试剂盒说明书进行。空白对照吸光度进行调零，依据标准品浓度生成标准曲线，以各样品的吸光度在标准曲线上得到对应的样本浓度。

1.3 统计学处理 两组间指标的比较以独立两样本t检验分析，若方差不齐以t'检验;3组间指标比较行方差分析，若方差不齐则进行秩和检验;炎性肌病组样本量少，两变量进行秩相关分析。

2 结果

2.1 穿孔素和颗粒溶素在PM和DM中的比较穿孔素在PM和DM患者血清中表达水平比较，t'=－0.900，差异无统计学意义(P ＞0.05);颗粒溶素在两组间比较，t=0.348，差异无统计学意义(P＞0.05)，结果见表 1。

表1 穿孔素和颗粒溶素在PM和DM的表达

2.2 穿孔素和颗粒溶素在3组间的比较 穿孔素在炎性肌病组、正常对照组和类风湿关节炎组间无显著差异(P＜0.05);颗粒溶素在类风湿关节炎组和炎性肌病组均高于对照组(P＜0.05)，而在类风湿关节炎组和炎性肌病组间无差异(P＞0.05)，见表2。穿孔素进行方差分析(F=0.357，P=0.703)，3组间无差异。颗粒溶素方差不齐行秩和检验(F=3.873，P=0.03)。炎性肌病组和类风湿关节炎组分别与对照组比较(P＜0.01和 P＜0.05);炎性肌病组和类风湿关节炎组间比较(P＞0.05)。

表2 3组穿孔素和颗粒溶素的比较

2.3 穿孔素和颗粒溶素相关分析 对20例炎性肌病患者(PM/DM)的穿孔素和颗粒溶素进行相关分析，因样本量偏小故不能进行多因素的相关及回归分析，且穿孔素和颗粒溶素非正态分布，以秩相关(spearman等级相关)检验，发现两者不存在相关性(rs=0.018，P ＞0.05)。

2.4 炎性肌病激素敏感与抵抗的比较 随访6月发现5例炎性肌病激素抵抗患者(PM 2例、DM 3例)，选取7例炎性肌病激素敏感患者(PM 3例、DM 4例)进行对比研究。激素敏感与抵抗的标准以Thomas标准判断［2］。经两组样本秩和检验，两者治疗前穿孔素、颗粒溶素、肌力、肌酸激酶无差异(P＞0.05)。提示穿孔素和颗粒溶素、肌力及肌酶不能预测炎性肌病对激素治疗敏感与否。

3 讨论

多发性肌炎和皮肌炎患者肌肉组织中有大量的T淋巴细胞浸润，在PM中主要为CD8+T细胞，该细胞能分泌大量的穿孔素［3］，PM肌活检中，与肌细胞接触的CD8+T细胞有43%的细胞穿孔素呈偏向性分布。而穿孔素在DM的T细胞中呈弥漫性分布。由此推测，在DM中T细胞可能是被非特异性活化，而在PM中T细胞具有抗原特异性，识别肌细胞表面抗原，分泌穿孔素杀伤靶细胞［4］。日本学者［5］通过免疫组化发现PM肌肉组织中穿孔素表达阳性的CD8+T细胞占9.9%，而在DM中很少出现阳性。从而推断穿孔素在PM发挥着重要的溶解肌细胞作用。

在体内免疫毒性细胞杀伤靶细胞的途径和机制主要有两种［6］:①FAS途径经死亡受体起作用;②毒性颗粒途径。当细胞毒性T细胞(CTL)和自然杀伤细胞(NK)细胞受到抗原刺激后，被活化并识别靶细胞，CTL和NK细胞内胞浆颗粒重定向并移至与效应靶细胞接触部位，通过出胞作用以分泌性溶酶体形式将毒性颗粒释放到细胞间隙。毒性颗粒成分主要包括穿孔素和颗粒酶。CTL和NK细胞的溶细胞颗粒中除了发现穿孔素、颗粒酶外还有颗粒溶素［7］。颗粒溶素是存在于CTL和NK胞浆颗粒中的溶细胞蛋白质分子，并有促进炎症反应作用［8］。颗粒溶素损伤细胞的机制可能是当颗粒溶素和靶细胞带负电荷的线粒体膜脂质结合导致溶解活性发生［9］。这种机制诱导细胞色素C的释放和线粒体功能的下降，这种改变与穿孔素小孔的形成有关［10］。Walch 等［11］发现在穿孔素存在下，颗粒溶素依赖的细胞溶解作用加强。也就是说两者相互协同损伤细胞。我们的研究拟探讨炎性肌病患者血清穿孔素和颗粒溶素是否呈高表达，及两者是否存在相关性。本研究通过对比炎性肌病组(包括DM和PM)和类风湿关节炎组及正常对照发现:穿孔素在炎性肌病组、正常对照组和类风湿关节炎组间无显著差异(P＜0.05);颗粒溶素在类风湿关节炎组和炎性肌病组均高于对照组(P＜0.05)，而在类风湿关节炎组和炎性肌病组间无差异(P＞0.05)。提示颗粒溶素在炎性疾病中的意义可能较穿孔素还要重要。一直以来对穿孔素的研究主要集中在PM，我们通过PM组和DM组间t检验未发现血清中穿孔素和颗粒溶素的表达在PM和DM存在差异。这与日本学者［5］通过免疫组化检测CD8+T细胞中穿孔素表达结果不同。

临床中常遇到激素治疗抵抗的患者，如何在治疗早期找到预测激素抵抗的标志物是非常有意义的。Sarwal等［12］在研究激素治疗肾移植排斥发现:在激素治疗抵抗的移植组织中颗粒溶素染色较激素敏感者高。得出:组织颗粒溶素的致密染色是糖皮质激素抵抗的组织标志。提示当颗粒溶素高表达时，可以出现糖皮质激素抵抗。Ikezoe等［13］发现在多发性肌炎治疗前的活检标本中，激素抵抗患者组织较激素治疗敏感患者组织颗粒溶素在CD8+淋巴细胞中表达明显升高。穿孔素和颗粒溶素在同种颗粒中表达。虽然糖皮质激素抵抗的多发性肌炎中穿孔素表达升高，但在糖皮质激素抵抗组和敏感组间没有显著差异。这与我们的研究是一致的，我们对激素敏感与抵抗的炎性肌病患者比较发现穿孔素的表达没有差异(P＞0.05)。Ikezoe还得出颗粒溶素的表达和糖皮质激素抵抗成正相关，因而提出:Sarwal［12］将颗粒溶素的表达可作为肾移植急性排斥激素抵抗的标志，那么颗粒溶素也可能作为多发性肌炎激素抵抗的标志。因此我们希望在血清中发现颗粒溶素与激素抵抗的关系，但我们在对比激素敏感与抵抗的炎性肌病患者中未发现颗粒溶素表达存在差异(P＞0.05)，即颗粒溶素尚不能作为预测疗效的标志。这可能与我们的样本含量偏小有关。

有学者［14］提出颗粒溶素和糖皮质激素受体多态性可能是预测炎性肌病对糖皮质激素反应性有潜在意义的两个研究方向。穿孔素和颗粒溶素在炎性肌病免疫损伤中的意义日益受到关注。

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