复方山菊对自发性高血压大鼠肾脏的保护作用及机制

李文星，杨解人，张俊秀，唐丽娟，杨 慧，陈国祥

(皖南医学院 药理学教研室，安徽 芜湖 241002)

高血压导致终末期肾病(end-stage renal disease，ESRD)的发生率呈上升趋势。近年来，美国ESRD的发病率以每年9%的速度增长，其中因高血压而引起的ESRD患者占28%，这提示着临床上抗高血压药物对肾功能的保护作用还远远不够［1］。因此，研究和开发防治高血压肾损害的药物有着重要的意义。

自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)血压在16 周龄时可达180 ～200 mmHg，发病机制以及并发症等都与人类高血压患者相似，是目前国际上公认人类原发性高血压及其并发症研究和药物筛选最佳的动物模型［2］。

复方山菊是由野菊花、淫羊藿、罗布麻叶及钩藤组成的新型复方中药制剂。其中山菊有降压、抑制血小板聚集、抗炎抗氧化的作用［3］。淫羊藿对内皮细胞具有保护作用，有保护心血管、调节免疫的作用［4］。罗布麻叶有降压、降脂、增强免疫功能等作用［5］。钩藤能降压、抗心律失常、抑制血小板聚集和抗血栓形成作用［6］。临床应用证明，将上述4种中药组成复方山菊制剂具有降压作用，我们前期动物实验也证实口服复方山菊能明显降低SHR血压和血脂以及血粘度［7］，具有改善SHR心肌肥厚，降低血尿酸等作用［8］，但长期应用对SHR肾脏损伤是否具有保护作用，目前未见报道，本试验采用SHR，连续灌服复方山菊16周，观察其对肾脏损伤的保护作用及可能机制，为临床用药进一步提供实验和理论依据。

高血压能增加肾小球毛细血管内压，使肾脏固有细胞产生多种炎性因子、生长因子和血管活性物质。这些活性因子通过自分泌和旁分泌等途径进一步作用于系膜细胞等肾固有细胞，导致细胞外基质(extracellular matrix，ECM)积聚，从而造成肾小球硬化，最终导致肾衰竭。TGF-β1是最重要的促纤维化因子，在肾小球硬化发生的最后通路作用尤为重要。TGF-β1可以刺激系膜细胞增殖，增加肾小球连接蛋白、胶原纤维、蛋白多糖等合成，使ECM合成增加，最终诱发肾小球硬化和肾小管肾间质纤维化［9，10］。而诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)，导致机体产生大量的和 NO，直接引起肾小球细胞损伤［11～13］。故本文从这两条途径来探讨复方山菊对肾脏损伤保护作用的可能机制。

1 材料和方法

1.1 动物 雄性16周龄SHR 35只，Wistar-Kyoto(WKY)大鼠7只，体重(300±50)g。许可证号SCXK(沪)2007-0005，上海斯莱克实验动物有限责任公司。颗粒饲料，南京青龙山动物试验中心。自然光照，自由进食饮水，室温(23±2)℃，相对湿度60% ～65%。

1.2 药物和试剂 复方山菊(芜湖市中医院提供，090314)，临床剂型为胶囊，每粒含原药0.1 g，实验用药物为原药粉剂，其中1.0 g原药相当于15 g生药。卡托普利(常州制药厂有限公司，09102411)，10 mg/片。HE染色剂:苏木精，伊红。Masson染液试剂盒(南京建成生物工程研究所)。免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。RT-PCR试剂盒(北京天根生化科技有限公司)。PCR引物:TGF-β1 上 游 引 物 5'-GCGACTCCTGCTGCTTT-3'，TGF-β1 下游引物 5'-CTGGCGAGCCTTAGTTTG-3'，扩增产物大小为350 bp(南京金斯瑞生物科技有限公司)，β-actin上游引物5'-GGACTCATCGTACTCCTGCT-3'，下游引物5'-GTAAAGACCTCTATGCCAACA-3'，扩增产物大小为469 bp。

1.3 分组及给药 复方山菊成人每日用量为0.4g(4粒)，按60 kg计算，折算成大鼠等效量为0.047 g/kg，以0.05 g/kg为等效量(低剂量组)，按3倍递增为0.15 g/kg(中剂量组)，0.45 g/kg(高剂量组)。SHR 35只，给药前测量大鼠清醒状态血压，根据血压随机分为5组:SHR(蒸馏水5 ml/kg)对照组，复方山菊低剂量组(0.05 g/kg)、中剂量组(0.15 g/kg)、高剂量组(0.45 g/kg)，卡托普利(0.03 g/kg)阳性对照组，每组7只。另设WKY正常对照组(蒸馏水5 ml/kg)7只。按上述剂量，每日下午5时灌胃给药(容积为5 ml/kg)，每日1次，连续16周。

1.4 HE染色和Masson染色 末次给药后，3%戊巴比妥钠(10mg/kg)麻醉，取肾脏组织，滤纸拭干。10%甲醛固定，包埋，切片，HE染色，光镜观察肾组织病理学改变。Masson染色(具体步骤参照试剂盒说明书)肾组织切片，光镜下观察肾胶原纤维的表达。

1.5 免疫组化法表达肾组织中iNOS蛋白 肾组织石蜡横断面切片，厚度约4 μm/片，常规脱蜡至水，染色程序严格按照试剂盒步骤进行，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片观察。实验步骤参照试剂盒说明书。

结果判断:iNOS定位于肾小球细胞的胞浆及胞膜。阳性细胞呈黄至棕黄色。所有染色切片在同一条件下采用Image-pro plus图像分析软件进行半定量分析，测定其平均积分光密度值(AIOD)，阳性表达水平用AIOD(±s)表示，AIOD越大其iNOS表达水平愈高，反之则表达水平愈低。

1.6 RT-PCR法表达肾脏TGF-β1 mRNA Trizol一步法提取肾皮质总RNA，测量各组260 nm和280 nm紫外吸收值(A)，重复测定3次。结果各组A260/A280在1.8～2.0之间，说明所提RNA纯度高。根据A260值计算RNA浓度。取总RNA 2 μg做逆转录，实验步骤参照逆转录试剂盒说明书进行。取1 μg cDNA逆转录产物为模版，再利用特异性引物扩增目的片段，反应体系为25 μl。目的基因扩增条件如下:94℃预变性3 min;94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，扩增30个循环，再次72℃延伸5 min。取5 μl扩增产物在含溴化乙锭(EB)的1.5%琼脂糖凝胶中电泳，采用Image-pro plus图像分析软件进行半定量分析，条带强度用IOD值表示。目的基因的信号强度以目的基因/β-actin的IOD比值来确定目的基因的表达。

2 结果

2.1 复方山菊对自发性高血压大鼠肾小球HE染色的影响 光镜下，WKY大鼠肾小球大小形态正常，毛细血管袢开放，系膜细胞和基质无增生，基质膜未增厚，肾小管上皮细胞无变性，管腔内未见管型，肾间质未见纤维化及炎细胞浸润，肾小动脉管壁无增厚。与WKY比较，SHR肾小球球性硬化伴萎缩，肾小管颗粒变性伴萎缩，肾间质多灶性纤维化伴淋巴-单核细胞浸润，肾小动脉管壁增厚，管腔狭窄，说明SHR伴有严重的肾小球损伤。与SHR比较，随着复方山菊剂量的增加肾小球系膜细胞和基质增生逐渐减轻，肾小管颗粒变性逐渐改善，肾间质内炎细胞浸润逐渐减少，纤维化逐渐减轻，肾小球病变有明显的改善，说明复方山菊对SHR肾小球损伤有一定的改善作用(图1)。

图1 复方山菊对自发性高血压大鼠肾小球HE染色的影响(400×)Fig 1 Effects of compound Shanju on renal glomerulus of SHR by HE staining(400×)

2.2 复方山菊对自发性高血压大鼠肾小球MASSON染色的影响 MASSON染色显示胶原纤维为蓝色，与WKY比较，SHR肾小球系膜区出现明显蓝色深染，说明SHR肾小球伴有严重的胶原沉积。与SHR比较，随着复方山菊剂量的增加，肾小球系膜区蓝色深染逐渐减少，胶原沉积现象逐渐减轻，说明复方山菊对SHR肾小球胶原沉积有一定的改善作用(图2)。

图2 复方山菊对自发性高血压大鼠肾小球MASSON染色的影响(400×)Fig 2 Effects of compound Shanju on renal glomerulus of SHR by Masson's trichrome staining(400×)

2.3 复方山菊对自发性高血压大鼠肾小球iNOS表达的影响 免疫组化显示，阳性表达为棕黄色颗粒，SHR棕黄色颗粒较多(图3)，通过对其AIOD进行半定量分析得出，肾小球iNOS表达显著增加(P＜0.01)(图4)，与SHR比较，随着复方山菊剂量的增加棕黄色颗粒逐渐减少(图3)，肾小球iNOS表达逐渐减少(P＜0.01)(图4)。说明复方山菊能下调SHR肾小球iNOS的表达。

图3 复方山菊对自发性高血压大鼠肾小球iNOS表达的影响(400×)Fig 3 Effects of compound Shanju on the expression of iNOS in renal glomerulus of SHR(400×)

图4 复方山菊对SHR肾小球iNOS平均积分光密度值(AIOD)的影响(±s，n=7)Fig 4 Effects of compound Shanju on AIOD of iNOS in renal glomerulus of SHR(±s，n=7)

2.4 复方山菊对自发性高血压大鼠肾脏TGF-β1 mRNA表达的影响 与WKY比较，SHR肾脏TGF-β1 mRNA表达显著增加。与SHR比较，复方山菊高、中剂量和Cap组肾脏TGF-β1 mRNA表达减少(P＜0.01)。说明复方山菊和Cap能下调SHR肾脏 TGF-β1 mRNA(图 5)。

3 讨论

本实验研究结果显示，SHR肾小球球性硬化伴萎缩，肾小管颗粒变性伴萎缩，肾间质多灶性纤维化伴淋巴-单核细胞浸润，肾小动脉管壁增厚，管腔狭窄，系膜区胶原纤维沉积，说明SHR伴有严重的肾小球损伤。经复方山菊16周治疗后，SHR肾小球系膜细胞和基质增生逐渐减轻，肾小管颗粒变性逐渐改善，肾间质内炎细胞浸润逐渐减少，纤维化逐渐减轻，系膜区胶原纤维沉积逐渐减少，肾小球病变有明显的改善，表明复方山菊对SHR肾小球损伤具有改善作用。

图5 复方山菊对SHR肾脏TGF-β1 mRNA表达的影响(±s，n=7)Fig 5 Effects of compound Shanju on the expression of TGF-β1 mRNA in renal glomerulus of SHRA:Expression of TGF-β1 mRNA in renal glomerulus of SHR(1.WKY，2.SHR，3.compound Shanju 0.45 g/kg，4.compound Shanju 0.15 g/kg，5.compound Shanju 0.05 g/kg，6.Cap 0.03 g/kgB:Histogram represents integrated optical density(IOD)normalized to the corresponding β-actin(±s，n=7，a P＜0.05，aa P＜0.01 vs WKY;b P ＜0.05，bb P ＜0.01 vs SHR;c P ＜0.05，cc P ＜0.01 vs Cap

复方山菊通过何种机制保护SHR肾小球?文献报道，高血压时肾小球内高压，使肾小球内血管内皮细胞功能损伤，导致舒血管物质一氧化氮(NO)和前列环素(PGI2)合成减少，肾素-血管紧张素系统(RAS)激活，血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)生成增加;而AngⅡ可诱导肾脏系膜细胞产生转化生长因子β1(TGF-β1)。TGF-β1以自分泌、旁分泌和内分泌的方式，激活Smad2、Smad3和 Smad4，形成多聚体进入胞核内，诱导和刺激胚胎基因表达，激活MAPK途径，促进肾小球系膜细胞增生、细胞外基质(ECM)形成和沉积，抑制ECM降解，促使ECM在系膜区聚积，最终诱发肾小球硬化和肾小管肾间质纤维化［9，10］。进一步实验显示，复方山菊高、中剂量组的肾小球TGF-β1 mRNA表达比SHR组显著下降，说明复方山菊可通过下调肾小球TGF-β1 mRNA的表达，从而减少肾小球胶原沉积，减轻肾小球硬化。

此外，高血压时，活性氧(ROS)生成增多，NF-κB被激活，激活的NF-κB可增加 TGF-β1的生成，促使ECM聚积，而这又反过来进一步激活NF-κB，大量被激活的NF-κB可活化生成诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)，导致机体产生大量的和NO，引起肾小球细胞损伤［11～13］。本次研究结果显示复方山菊高中剂量组肾组织iNOS的表达与SHR组相比有显著下降，说明复方山菊可通过下调SHR肾脏iNOS蛋白的表达，减轻肾小球细胞的变性、萎缩、玻璃样变等病理性损伤。说明复方山菊是通过下调肾小球TGF-β1 mRNA和iNOS蛋白的表达，以减少肾小球胶原沉积，减轻肾小球硬化和肾小球细胞的病理损伤，从而改善肾功能，产生保护肾脏的作用。

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