改良组织芯片技术在胃癌研究中的应用及体会

刘银华，张修稳，卢林明，赵国海

(1.皖南医学院附属弋矶山医院 病理科，安徽 芜湖 241001;2.皖南医学院附属弋矶山医院 急诊外科，安徽 芜湖241001;3.皖南医学院 病理学教研室，安徽 芜湖 241002)

组织芯片(tissue chip，TC)是用大量组织标本高密度排列而成的组织微阵列(tissuemicroassays)，即微缩组织切片。Kononen等［1］于1998年在Nature Medicine上首次报道了组织芯片这一高通量技术，在一张组织芯片上有序地固定着成百甚至上千个组织样本，每个样本为圆盘状，直径为0.6～2.0 mm。这样的组织芯片可被用来做特定的分子分析如DNA、mRNA的原位分子杂交和蛋白的免疫组织化学染色等。作为一种新型生物芯片，该技术自问世以来，已经在乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌等肿瘤的研究中广泛应用，本研究通过制备大规模胃癌组织芯片，探讨组织芯片制作方法的优化以及其在胃癌组织中的应用价值。

1 资料和方法

1.1 一般资料 调取皖南医学院附属弋矶山医院胃肠外科2007年1月～2010年12月的胃癌手术病例，共1 235例，其中男性874例，女性361例，年龄42～79岁，平均(61.4±8.3)岁。

1.2 组织芯片的设计与制作

1.2.1 空白蜡块制作 选取62～67℃纯蜂蜡(上海华申康复器材厂)放入98℃温箱内融化1 h，弃去底部沉渣后用蜡块制作模具制成长宽高为34 cm×24 cm×2 cm大小蜡块。

1.2.2 受体蜡块制作 首先我们用刻度尺和手术刀片在空白蜡块上画格，横竖间距均为2.5 mm，距边缘约2 mm;再应用组织微阵列制作仪，在已画好的方格内打孔，制作成8×12阵列的受体蜡块，每个微孔的直径为1.2 mm，间距约为1 mm，深约3 mm(见图1);本实验使用的组织微阵列制作仪系由北京博医康医疗仪器有限公司所生产，该仪器配备有定位仪以及直径分别为0.9 mm、1.2 mm、1.6 mm三种规格的打孔采样针。本实验中，我们对定位方法进行了优化，使用在空白蜡块上画格定位的方法，舍弃仪器自带的横纵螺旋定位装置。

1.2.3 供体蜡块的取样及点样 首先用显微镜在HE切片标记肿瘤组织，再根据HE切片上的标记在供体蜡块上选取相应部位作为取材位点。使用组织芯片仪挖取点样组织，依从左到右，自上而下的次序置入受体蜡块内。在每个受体蜡块左上角的第一个孔内置入肝组织作为标记，同时记录每个标本在二维阵列中的具体位置(见图2)。

1.2.4 融蜡 将含有标本组织的阵列蜡块底部垫上硬纸板，放入70℃的温箱，加温约20 min。由于纯蜂蜡熔点较低，可较快溶解包裹组织芯，故融蜡时间不宜太长。建议初次融蜡时可每隔5 min看一次，以硬纸板上可看到液体石蜡轻微浸润时为准，取出切片，切片过程与常规组织切片基本相同。

1.3 免疫组织化学SP法 本次实验共成功制备胃癌组织芯片13枚，包含1 235例胃癌组织，随机抽取1个组织芯片切片进行免疫组化染色，用于与普通石蜡切片进行对比，检测制作效果。将普通石蜡切片与组织芯片蜡块切片同一批进行免疫组化染色，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，PBS液洗5 min×3次，3%H2O2室温孵育10 min，PBS液洗5 min×3次，高压锅抗原修复(修复液为0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液，pH 6.0)，PBS液洗5 min×3次，滴加P16一抗工作液，4℃冰箱过夜，PBS洗5 min×3次，滴加二抗工作液，37℃孵育15 min，PBS洗5 min×3次，滴加卵白素过氧化物酶复合物，37℃孵育10 min，PBS洗5 min×3次，DAB 显色剂显色 7 min。以PBS液代替一抗作阴性对照，用已知阳性片作阳性对照(见图3、4)。试剂鼠抗人P16多克隆抗体及S-P检测试剂盒均购自福州迈新生物技术有限公司。

1.4 结果判定 P16阳性细胞染色定位于细胞质，以胞质中有浅黄、棕黄或棕褐色颗粒者为染色阳性，按染色强度判为浅黄(0分)、棕黄(1分)及棕褐色(2分)3级;按照阳性细胞比例分为＜10%(0分)、10% ～30%(1分)、31% ～60%(2分)及 ＞60%(3分)4级。总体评分值=阳性细胞比例评分×染色强度。评分:≤2分者判为阴性，3～6分者为弱阳性，＞6分者为强阳性。

1.5 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件包进行处理，采用配对χ2检验。

2 结果

2.1 组织芯片制作的改良

2.1.1 在制作空白受体蜡块时，我们比较了在纯蜂蜡中加入不同比例的普通石蜡，但最终还是认为使用纯蜂蜡较好，具体优点体现在以下三方面:①柔韧性好，有效地避免了打孔时开裂，而其他蜡块在打孔时均出现了不同程度开裂，且打孔不受时间和室温限制［6，7］;②可使微孔间距缩小至 1 mm 左右，最大程度地保证了在同样大小的受体蜡块上尽可能多地放入了样本组织;③融点较组织芯石蜡低，有效包裹组织芯，避免了切片时组织芯的脱落。

2.1.2 制作受体蜡块时，创造性地使用了蜡块表面画格法，相对于使用定位仪，画格的方法加快了受体蜡块的制作效率且各孔间分布更为均匀(见图1～3)。本实验芯片制作速度明显加快，且定位更加准确、方便，微孔布局更趋合理，充分凸显出组织芯片技术在大样本检测中的优势。

2.1.3 “二次点样”:由于供体蜡块过厚或过薄，常导致挖取的点样组织厚度不一。本次实验处理时对于过厚的组织在用实心针芯缓缓推出时先用刀片酌量削去部分，对于过薄的组织则采用“二次点样”，即在同一孔两次置入同一供体组织，这样既可以保证每孔内含有足够的待检组织，又可以使组织芯的平面基本一致，利于制片。

本次实验我们随机抽取制作的1张切片，所有芯片组织排列整齐，共96个组织位点，8个位点缺失，个别组织芯发生位移，不影响结果的判断(见图4、5)。

2.2 免疫组织化学染色 1块组织芯片88例胃癌组织中P16蛋白表达的阳性率为35.2%(31/88)，普通切片的阳性率为31.8%(28/88)，采用配对χ2检验P=0.629，依据α=0.05的水准，两者之间无统计学差异(P＞0.05)，提示组织芯片与普通免疫组化标记结果基本一致。

表1 组织芯片与普通切片胃癌中P16蛋白的表达(n)Tab 1 The P16 protein expression detected by immunohistochemistry and tissue microarray technology in conventional sections from gastric cancer(n)

图1 8×12阵列打孔后蜡块Fig 1 8 x 12 Paraffin-embedded tissue block after micro-array drilling

图2 8×12阵列组织芯片Fig 2 8 x 12 Micro-arrays of tissue chip

图3 胃癌组织芯片HE染色Fig 3 Tissue micro-array for gastric cancer(HE staining)

图4 胃癌组织芯片免疫组化染色Fig 4 Tissue micro-array for gastric cancer by immunohistochemical staining

图5 普通胃癌组织切片免疫组化染色Fig 5 Tissue array slide of common gastric cancer tissues stained with immunohistochemistry

3 讨论

TC也称组织微阵列(tissue micro array，TMA)，是在单位面积的载体上，以微阵列的形式，按不同的设计要求，顺序地放置数个到数百个乃至数千个集群标本，包括集群细胞、组织、器官的样本。作为一种新型生物芯片，该技术自1998年问世以来，已应用于多种肿瘤的研究［1～5］，由于其具有高信息量、实验误差小、标本利用率高和成本低等优点，又如同普通组织切片一样，可以做HE、特殊组织化学、免疫组织化学染色和原位杂交，故为寻找肿瘤基因、检测生物试剂、质控及标准化等方面的有效方法。本研究对组织芯片制作过程进行了适当优化后加快了其制作效率，凸显出该技术在大样本标本检测中的优势。实验中我们使用的蜡块表面画格法，即在空白受体蜡块表面画出大小均一的正方形方格，做到了行列间距的完全一致，使定位极为准确且操作快速、简单;同时，在空白的受体蜡块的制作上，选用纯蜂蜡作为原料，有效避免了脱片和开裂，且不受时间和室温限制，省略了水浴恒温的步骤，大大加快了受体蜡块的制作速度，明显优于现有的仪器和方法。另外，“二次点样”的应用在很大程度上解决了个别供体蜡块过厚或过薄的问题，使制片过程简单化，同时确保了微孔内含有足够的待检组织。在本实验中，两张组织芯片切片中共有8个位点发生缺失，可能还是因为在点样过程中供体蜡块较薄所致，最终导致点样后组织芯没有与受体蜡块表面平齐，切片时难以将该位点有效切入。所以，除上述所介绍的“二次点样”办法外，还可以通过适当增加切片张数来解决该问题。

p16基因定位染色体9q21，编码相对分子质量为16 ku的P16蛋白，特异性抑制细胞周期蛋白依赖性激酶4和6活性，调控细胞周期，参与了人类多种肿瘤的发生和发展，故又称多种肿瘤抑制基因。多项研究［8～11］表明胃癌组织中存在p16基因启动子区甲基化和P16蛋白表达降低，并与胃癌组织类型、分化程度及转移密切相关。本实验分别用两种方法检测P16蛋白在胃癌组织中的表达均在35%左右，这与我们前期的研究相一致［12］。两种方法所测结果经χ2检验无统计学意义，表明组织芯片与普通切片检测结果基本一致。

综上所述，此次改良组织芯片制作方法简单、快捷，在保证质量的同时，简化了流程，降低了操作难度，提高了效率。且组织芯片具有普通切片无法比拟的优越性:体积小、数量多、形状规则，排列有序，检测结果的科学性和可比性强，信息量大，效率高，消耗试剂少;可明显提高实验效率、有助于减少实验误差、有利于原始存档蜡块的保存，相信组织芯片技术必将在肿瘤的诊断和研究领域中发挥更加重要的作用。

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