NF-κBp50、JAB1和CRM1在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的表达及其意义

周永清，柴 琳

(皖南医学院 医学三系，安徽 芜湖 241002)

弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是最常见的非霍奇金淋巴瘤(NHL)，在西方国家占成人NHL的30% ～40%，在我国等发展中国家发病率则更高一些。其在病理学特征、生物学行为和临床表现上都具有显著的异质性，是一组高度异质性B细胞恶性淋巴瘤［1］。核因子κB(NF-κB)是一种具有多向调节功能的核转录因子，参与多种不同细胞的增殖、凋亡相关基因及癌基因的启动和转录调控，被证实与肿瘤发生、生长、侵袭、转移和耐药等各个阶段密切相关［2］。NF-κB活化现象在非霍奇金淋巴瘤中较为普遍，且发现NF-κB 通路活化与 DLBCL 的不良预后有关［3］。JAB1通过与转录调节蛋白AP-1特异位点结合形成稳定复合物，促进靶基因的反式激活，参与许多细胞信号转导通路，包括调节整合素信号、细胞周期调控和甾体类激素的信号转导等。JAB1在实体肿瘤中研究较多，而在淋巴瘤中的研究报道较少［4，5］。出核因子-1(CRM1)是真核细胞中最重要出核转运蛋白之一，能够识别细胞核内某些具有核定位序列和(或)核输出信号的蛋白分子，并与之特异性结合，介导生物大分子的出核转运。本文应用免疫组化技术检测 DLBCL中 NF-κBp50和 JAB1、CRM1的表达，探讨三者在非霍奇金淋巴瘤发生、发展中的作用以及对诊断、分型的意义。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集南京军区南京总医院病理科2006年6月～2010年5月DLBCL存档石蜡组织标本94例，男性56例，女性38例;年龄14～84岁，平均年龄(54±17)岁;结内30例，以头颈部、腋下、腹股沟等浅表淋巴结为主;赤结外64例，以胃肠道为主;其次是扁桃体、乳腺、骨组织等，其中在结外特殊部位中原发于中枢神经系统17例，纵隔2例。按照2008年WHO淋巴瘤分类［6］将DLBCL分为GCB型24例，non-GCB型68例，CD5+型2例。另外选取10例反应性增生的淋巴组织作为对照。

1.2 主要试剂 兔抗人多克隆抗体NF-κBp50为SantaCruz公司产品，稀释浓度1∶50，购自北京中杉金桥生物技术有限公司，兔抗人JAB1多克隆抗体为BD公司生产，CRM1多克隆抗体SantaCruz公司产品，稀释浓度1∶200，均购自江苏希望生物科技有限公司。

1.3 方法 采用SABC免疫组化染色法，石蜡标本制成3～4 μm的切片，常规烘烤、二甲苯及乙醇脱蜡至水，加3%H2O2灭活内源性过氧化物酶，浸泡于枸橼酸缓冲液(pH 6.0)中，高压加热行抗原修复，滴加5%BSA封闭液，滴加一抗放冰箱4℃冷藏过夜，次日依次滴加生物素化二抗、SABC复合物、DAB显色，苏木精复染，经乙醇及二甲苯脱水透明后封固。以PBS液代替一抗作阴性对照，乳腺癌切片作为阳性对照。

1.4 结果判定 NF-κBp50主要定位于淋巴细胞的细胞核和胞质，JAB1、CRM1的免疫染色主要定位于淋巴细胞的细胞核、少数胞质阳性。根据肿瘤细胞阳性表达染色强度和阳性细胞数百分比评分，染色强度评分:无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分(细胞着色深浅需与同一切片背景着色内对照)。阳性细胞数百分比评分:阴性为0分，≤10%为1分，11% ～50%为2分，51% ～75%为3分，≥76%为4分。两积分相乘，0～3分为阴性(－)，3～6分为弱阳性(+)，6～9分为中等阳性()，9～12分为强阳性()。

1.5 统计学处理 应用SPSS 13.0统计软件进行分析。计数资料采用 χ2检验;等级相关性采用Spearman等级相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NF-κBp50、JAB1 和 CRM1 在淋巴结反应性增生和DLBCL中的表达 10例淋巴结反应性增生中NF-κBp50仅表达于滤泡生发中心和副皮质区少量免疫母细胞(图1a)，JAB1和CRM1在滤泡生发中心部分细胞弱阳性表达，而在套区小淋巴细胞、副皮质区的小淋巴细胞不表达(图 1b、1c)，NF-κBp50、JAB1和CRM1在淋巴结反应性增生中的阳性表达率分别为 30.0%(3/10)、40.0%(4/10)和 30.0%(3/10)。NF-κBp50、JAB1 和 CRM1 在 DLBCL 中的阳性表达均主要位于细胞核，阳性表达率分别为70.2%(66/94)、77.7%(73/94)和 69.1%(65/94)(图 2a～c)。NF-κBp50、JAB1 和 CRM1 在 DLBCL中的阳性表达率均明显高于淋巴结反应性增生，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 DLBCL 中 NF-κBp50、JAB1 和 CRM1 的表达与临床病理指标之间的关系(表1)由表1可知，NF-κBp50在GCB型中的阳性表达率低于non-GCB型，差异有统计学意义(P＜0.05)。JAB1和CRM1与DLBCL的病理亚型均无相关性(P＞0.05)。NF-κBp50、JAB1和CRM1与患者性别、年龄、发病部位及特殊部位方面的差异均无统计学意义(P＞0.05)。

图1 NF-κBp50、JAB1、CRM1在淋巴结反应性增生中表达a.NF-κBp50在淋巴结反应性增生中表达 IHC(×100);b.JAB1在淋巴结反应性增生中表达IHC(×100);c.CRM1在淋巴结反应性增生中表达IHC(×100)Fig 1 NF-κBp50、JAB1 and CRM1 are positively expressed in case of reactive hyperplasia lymph nodea.NF-κBp50 is positively expressed in case of reactive hyperplasia lymph node IHC(×100);b.JAB1 is positively expressed in case of reactive hyperplasia lymph node IHC(×100);c.CRM1 is positively expressed in case of reactive hyperplasia lymph node IHC(×100)

图2 NF-κBp50、JAB1、CRM1 在 DLBCL 中表达a.NF-κBp50在 DLBCL中表达 IHC(× 200);b.JAB1在 DLBCL中表达 IHC(×200);c.CRM1在DLBCL中表达IHC(×200)Fig 2 Positive expression of NF-κBp50、JAB1 and CRM1 in case of DLBCLa.Positive expression of NF-κBp50 in case of DLBCL IHC(× 200);b.Positive expression of JAB1 in case of DLBCL IHC(× 200);c.Positive expression of CRM1 in case of DLBCL IHC(×200)

表1 DLBCL中NF-κBp50、JAB1和CRM1的表达与临床病理指标之间的关系Tab 1 NF-κBp50，JAB1 and CRM1 expression in DLBCL and clinicopathologic indictors

2.3 DLBCL 中 NF-κBp50 的表达与 JAB1、CRM1 表达的相关性(表2)根据表2可以看出，NF-κBp50和JAB1在DLBCL中的表达呈正相关(rs=0.209，P＜0.05)。同样，DLBCL 中 NF-κBp50 和 CRM1 的表达也呈正相关(rs=0.270，P ＜0.01)。

表2 DLBCL中NF-κBp50的表达与JAB1、CRM1表达的相关性Tab 2 Correlation of NF-κBp50，JAB1 and CRM1 expression in DLBCL

3 讨论

DLBCL是最常见的一种 NHL，因其在病理特征、生物学行为和临床表现方面具有显著异质性，WHO将其分成非特指性(NOS)、特殊亚型和独立疾病三类［6］。Hans等［7］依据 CD10、Bcl-6、MUM1、CD5等免疫表型将DLBCL分为GCB型、non-GCB型和CD5+型三个亚型，其中GCB型预后好于non-GCB型和CD5+型。此外WHO还分别列出如中枢神经系统、皮肤、纵隔等特殊部位，以及EBV、HHV8等病毒或感染相关的特殊亚型和独立疾病［8］。

NF-κB是一种核转录因子的蛋白质分子，广泛存在于细胞胞质中，目前已确认有 NF-κB1(p50/p105)，NF-κB2(P52)，RelA(P65)，RelB 和 c-Rel五个家族成员。其活性形式常见为异源二聚体p65/p50，其次是同源二聚体p50/p50和p65/p65。在静息状态下，与抑制蛋白 IκB 组成 NF-κB/IκB无活性的三聚体形式，而 IκB 在细胞中主要有 IκB α、γ、δ、ε、bcl-3等，作用是阻止NF-κB进入胞核，使其不能与DNA结合，同时可降解NF-κB-DNA聚合物。但在某些因素刺激下IκB被IκB激酶(IKK)磷酸化后降解，NF-κB被激活，其活化物 NF-κBp50由胞质向胞核转移，并与DNA间特异性结合，参与多种疾病不同阶段的细胞因子、生长因子及细胞粘附因子等一系列基因调控，已有证据表明NF-κB与肿瘤的发生密切关系［9］。Davis等［10］研究发现活化 B 细胞样DLBCL细胞系中具有较高的NF-κB DNA结合活性，而在生发中心B细胞样DLBCL细胞系中却没有，提示这两种亚型DLBCL具有不同的发病机制。我们的实验结果显示，NF-κBp50在淋巴结反应性增生中仅表达于滤泡生发中心和副皮质区散在的免疫母细胞，阳性表达主要在细胞质中，而在DLBCL，尤其是non-GCB型中的表达明显高于GCB型，且阳性表达位于肿瘤细胞胞质和胞核中，提示NF-κBp50必须进入细胞核才可激活，且其活化是non-GCB型DLBCL发病所必需的。

JAB1即C-JUN激活区结合蛋白1(C-JUN activation domain-binding protein 1，JAB1)，又名 COP9 信号体第 5亚单位(COP9 signalosome subunit 5，CSN5)，是1996年 Claret等［11］运用酵母双杂交系统从人淋巴细胞cDNA文库中筛选到的一种蛋白，其位于染色体8q13，是38 ku左右的可溶性核蛋白;在动、植物中均具有高度保守性，而人类JAB1则被定义为转录因子AP-1(activator protein 1)的共活化物，不仅调节AP-1转录活性，参与细胞增殖的调控;还与COP9信号体的亚单位相互作用，参与COP9复合体介导的激酶活性［12］，这些活动可能会引发26S蛋白酶体介导的p105，IкB经过泛素-蛋白酶体途径，使IкB，p105 及 NF-кB 前体磷酸化，p105 转变成 p50，即激活NF-кB。我们的实验结果发现JAB1在反应性增生的淋巴结中表达很弱，而在DLBCL中表达增强，阳性信号主要位于肿瘤细胞胞核、少量在胞质，表明在DLBCL中JAB1基因被激活。同时相关分析显示 DLBCL中 NF-κBp50与 JAB1呈正相关，但JAB1在DLBCL中的表达与性别、年龄、部位、特殊部位及病理亚型之间均无相关性，表明JAB1可能协同NF-κBp50参与DLBCL的发生和发展。

CRM1即出核因子-1(chromosome region maintenance 1)，又称为XPO1(Exportin-1)。CRM1不仅在真核细胞有丝分裂中具有保持染色体结构功能的作用，而且发现在核内大分子输出上具有重要作用，其在真核生物中保守性很强。细胞内许多蛋白可能定位在胞核或依赖能量在核质间穿梭而跨膜转运，CRM1可能介导RNA和这些目的蛋白的核输出。已有研究表明，IκB家族主要通过对NF-κB二聚体中NLS的掩饰，从而实现对NF-кBp50入核的抑制;但最常见的IκBα却只能掩饰NF-κB两个NLS中的一个，故还有一定量无 DNA结合活性的 NF-κB-IκBα可能趁机进入胞核内;为了保证胞核内的稳定，此时CRM1则识别并结合这些带有一段NLS的IκBα，形成出核转运复合体而被输出核外。CRM1在淋巴瘤中的研究甚少。本实验中同样发现CRM1在反应性增生的淋巴结中基本不表达，而在DLBCL中表达主要在肿瘤细胞胞核，且与NF-κBp50呈正相关，该结果提示CRM1不仅参与了DLBCL的发生，而且也协同NF-κBp50参与了DLBCL的发生发展。但CRM1在DLBCL中的表达与性别、年龄、部位和特殊部位及病理亚型之间无关，提示CRM1仅参与DLBCL的发生，而与其恶化进展无关。

大量研究表明DLBCL中GCB型5年生存率明显高于 non-GCB型，而 NF-κBp50在 non-GCB型中的表达明显高于GCB型。同时JAB1、CRM1二者主要通过对NF-κB出核运转和激活发挥正向调节作用，故 NF-κB p50和 JAB1、CRM1可作为 DLBCL 发生、发展和预后较为可靠参考指标，为DLBCL的临床个性化分子靶向治疗提供可行性依据。

［1］朱雄增，李小秋.解读2008年恶性淋巴瘤WHO分类［J］.临床与实验病理学杂志，2010，26(1):10 －13.

［2］KARINM，CAO Y，GRETEN F R，et al.NF-kappaB in cancer:frominnocent by stander to major culprit［J］.Nat Rev Cancer，2002，2(4):301 － 310.

［3］黄忠连，顾康生，孟刚.Bcl-2与NF-kB/p65在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的表达及意义［J］.山东医药，2007，47(4):3 －4.

［4］RASSIDAKIS GZ，CLARET F，LAI R，et al.Expression of p27Kip1 and c-jun activation binding protein 1 are inversely correlated in systemic anaplastic large cell lymphoma［J］.Clin Cancer Res，2003，9(3):1121 －1128.

［5］WANG Y，FEI M，CHENG C，et al.Jun activation domain-binding protein 1 negatively regulate p27kip1 in non-Hodgkin's lymphomas［J］.Cancer Biol Ther，2008，7(3):460 －467.

［6］SWERDLOW S H，CAMPO E，HARRIS N L，et al.Eds.World Health Organization classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues［M］.Lyon:IARC Press，2008:233 － 244.

［7］HANS CP，WEISENBURGER DD，GREINER TC，et al.Confirmation of the molecular classification of diffuse large B-ell lymphoma by immunohistochemistry using a tissue microarray［J］.Blood，2004，103(1):275 －282.

［8］朱雄增，李小秋.解读2008年恶性淋巴瘤WHO分类——B细胞淋巴瘤［J］.临床与实验病理学杂志，2010，26(2):125－130.

［9］TANG X，LIU D，SHISHODIA S，et al.Nuclear factor-kappaB(NF-kappaB)is frequently expressedin lung cancer and preneoplastic lesions［J］.Cancer，2006，107(11):2637 － 2646.

［10］DAVIS RE，BROWN KD，SIEBENLIST U，et al.Constitutive nuclear factor kappa B activity is required for survival of activated B celllike diffuse large B cell lymphoma cells［J］.Exp Med，2001，194(12):1861－1874.

［11］CLARET F X，HIBI M，DHUT S，et al.A new group of conserved coactivators that increase the specificity of AP2-1 transcription factors［J］.Nature，1996，383(6599):453 － 457.

［12］SEEGER M，KRAFT R，FERRELL K，et al.A novel protein complex involved in signal transduction possessing similarities to 26S proteasome subunits［J］.FASEB，1998，12(6):469 －478.