实时定量PCR检测自然流产患者HLA-G mRNA的表达

陈小梅，汪 泓，余彩铃，王 萍

(皖南医学院 1.医学一系;2.免疫学与微生物学教研室，安徽 芜湖 241002)

人类白细胞抗原-G(HLA-G)是一种具有独特分子结构的非经典的HLA-Ⅰ类分子，主要表达于绒毛外细胞滋养层上，具有较低的多态性，在诱导母胎免疫耐受中发挥重要作用，可抑制NK细胞及T细胞的杀伤作用，调节细胞因子的释放和诱导T细胞凋亡。近来研究均表明在不明原因的习惯性流产、妊娠高血压综合征等病理妊娠中HLA-G存在异常表达。本文采用实时荧光定量PCR检测自然流产与正常妊娠人工流产患者的绒毛组织中HLA-G mRNA表达水平，以探讨 HLA-G与自然流产的关系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 随机选取2010年5～8月在宣城地区医院及芜湖市第二人民医院妇产科进行自愿人工流产或自然流产的胚胎组织，其中人工流产的胚胎组织8例(对照组)，孕妇平均年龄(29.96±6.08)岁，平均孕周(7.54 ±0.76)周。自然流产患者的胚胎组织6例(实验组)，患者平均年龄(27.56±6.99)岁，平均孕周(8.11 ±1.10)周。经妇科超声检查、内分泌检查均无异常，排除感染、遗传、全身疾病，抗心磷脂抗体(ACA)、抗精子抗体、抗子宫内膜抗体均为阴性，夫妻双方染色体、免疫检查正常。

1.1.2 主要试剂 Simply P总RNA抽提试剂盒(BioFlux生物有限公司产品)，逆转录试剂盒(Fermentas公司产品)，SYBR® Green Realtime PCR Master Mix(购自上海东洋纺科技有限责任公司)，Bio S50(Bioflux公司产品)，6×Loading Dye solution(Fermentas公司产品)。

1.1.3 Real-time PCR 扩增引物 HLA-G(目的基因)引物、β-actin(β-肌动蛋白，内参照)引物(见表1)由上海生工合成。

表1 HLA-G、β-actin的引物Tab 1 Primers for HLA-G and β-actin amplification

1.2 方法

1.2.1 标本保存 取胚胎组织后，用无菌生理盐水清洗血污，置于密封无菌保鲜袋中，置－70℃低温冰箱保存。

1.2.2 绒毛组织总RNA的提取 自－70℃低温冰箱取出胚胎组织标本，于20℃室温缓慢解冻，用DEPC水配制的0.85%NaCl溶液清洗，剪取绒毛组织，剪碎，放入组织研磨器中，具体操作按总RNA抽提试剂盒说明书进行。

1.2.3 逆转录合成 cDNA 取2 μl总 RNA(1 μg/L)，并严格按照RNA逆转录试剂盒说明书操作，将总mRNA反转录成总cDNA。阳性对照为GAPDH RNA。

1.2.4 Real-time PCR的半定量分析 向反应管中加入 ddH2O 6.4 μl，SYBR® Green Realtime PCR Master Mix 10 μl，10 mol/L 上下游引物各0.8 μl，cDNA 模板2 μl，反应体系总体积为 20 μl。仪器使用罗氏lightCycler 2.0。循环条件为:95℃，30 s;40个循环，95℃，5 s;55℃，10 s;72℃，15 s;荧光检测。以β-actin基因的表达量作为内参，校正HLA-G基因的表达量，计算公式为:相对表达量=2－△Ct，△Ct=(目的基因Ct值－内参基因Ct值)。

1.2.5 Real-time PCR反应特异性鉴定 取15 μl扩增产物与3 μl上样缓冲液，点样于1.5%琼脂糖凝胶上(含 EB 0.5 μg/ml)，在0.5 × TBE 缓冲液中电泳，用Bio S50作为分子大小参照物，100 V稳压电泳30 min，自动凝胶成像分析系统(BIO-RAD Laboratories-Segrate)进行拍照。

1.2.6 结果计算与统计分析 采用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示，两组比较采用t'检验，以P＜0.05示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Real-time PCR结果 自然流产组绒毛组织中的HLA-G mRNA的相对表达量明显低于正常妊娠早孕人工流产组，差异有统计学意义(t'=－2.959，P ＜0.05)，见表2。

表2 自然流产与正常妊娠早孕人工流产HLA-G mRNA表达的差异(±s)Tab 2 Difference of HLA-G mRNA expression in cases between spontaneous abortion and normal pregnancy(±s)

表2 自然流产与正常妊娠早孕人工流产HLA-G mRNA表达的差异(±s)Tab 2 Difference of HLA-G mRNA expression in cases between spontaneous abortion and normal pregnancy(±s)

组别 例数(n)HLA-G mRNA(Ct均值)β-actin(Ct均值)△Ct值 相对表达量(2－△Ct )正常妊娠早孕人工流产 8 26.813 ±5.814 26.354 ±4.148 0.459 ±2.266 1.883 ±1.774自然流产 6 29.956 ±0.992 24.558 ±0.736 5.398 ±0.598 0.026 ±0.012

2.2 Real-time PCR鉴定结果 β-actin与HLA-G电泳谱较亮且无拖尾现象。β-actin扩增出147 bp左右的产物，HLA-G扩增出106 bp左右的产物。电泳结果见图1。

3 讨论

实时荧光定量PCR技术目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域，是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后对未知模板进行定量分析的方法，其有绝对定量和相对定量之分。绝对定量指用已知的标准曲线来推算未知的样本量;相对定量指在一定样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化，其又分为相对标准曲线法和比较Ct法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有快速、灵敏度高、特异性强、重复性好、定量准确等优点。

图1 Real-time PCR产物电泳图Fig 1 Electrophoregram of the real-time PCR products

HLA-G与妊娠的免疫耐受有着密切的关系，可通过多种机制诱导母胎间免疫耐受，尤其是对母胎界面中的免疫活性细胞(NK细胞、T细胞、B细胞、抗原提呈细胞以及内皮细胞等)间的调节作用，使胎儿免遭母体T淋巴细胞和NK细胞的攻击，维持正常妊娠［1］。Yie 等［2］回顾性研究发现，分泌 sHLA-G的胚胎卵裂率活产率显著高于sHLA-G缺乏者。认为胚胎sHLA-G水平和卵裂率对妊娠结局具一定预测价值。大多学者认为HLA-G表达异常将会导致反复自然流产［3］。范倩等［4］采用ELIAS法测得自然流产患者血清中sHLA-G明显低于正常妊娠者。邵剑春等［5］采用实时荧光定量PCR技术分别检测正常妊娠人工流产患者、单次自然流产患者、原因不明复发性流产患者绒毛中HLA-G mRNA的表达水平，发现适量的HLA-G mRNA表达水平有利于维持妊娠，而低的HLA-G mRNA表达水平可能会使胚胎在植入过程中容易被母体的免疫细胞攻击，而引起流产。朱晓明等［6］采用实时荧光定量PCR及Western印迹两种方法对重度子痫前期患者及正常妊娠胎盘组织中的HLA-G mRNA及蛋白进行定量，发现子痫前期患者胎盘中HLA-G mRNA及蛋白水平明显低于正常妊娠。Emmer等［7］发现，习惯性流产的妇女HLA-G的表达较健康妊娠者降低，同时外周血和蜕膜的NK细胞的含量升高，还发现神经管畸形的胎儿羊水中sHLA-G分子的含量降低。黄洁红等［8］在用实时荧光定量PCR检测反复自然流产绒毛组织中HLA-G及其各亚型的表达中，发现反复自然流产绒毛组织中总HLA-G mRNA较正常妊娠显著降低，以 HLA-G1，HLA-G3 降低为主。Goldman 等［9］通过RNA原位杂交法研究也发现，反复自然流产患者绒毛组织较正常妊娠妇女HLA-G mRNA的表达下降或缺失。

本研究采用实时定量PCR检查方法中的比较Ct法对自然流产及正常妊娠人工流产绒毛组织中HLA-G mRNA进行定量，结果表明自然流产组HLAG mRNA表达明显低于正常妊娠早孕人工流产组(P＜0.05)。此结果提示这一异常可能与自然流产的发病与病理生理过程有关，符合目前国内外研究结果，为研究自然流产发病机理、诊断及治疗开辟了新的途径。

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［4］范倩，汪泓，王萍，等.血清中sHLA-G水平与自然流产的关系［J］.皖南医学院学报，2011，30(5):383 －384.

［5］邵剑春，刘云东，胡大春，等.HLA-G mRNA在原因不明复发性流产患者绒毛中的表达［J］.中国妇幼健康研究，2010，21(1):56－57.

［6］朱晓明，杨瑛，张惠中，等.子痫前期胎盘组织中人类白细胞抗原G的表达及临床意义［J］.中华医学杂志，2006，86(11):775－776.

［7］EMMER PM，STEEGERS EA，VAN LIEROP MJ，et al.Amniotic fluid soluble human leukocyte antigen G is markedly decreased in offspring with neural tube defects［J］.Early Hum Dev，2002，66(2):101－105.

［8］黄洁红，李维枢，余琳，等.反复自然流产患者绒毛组织中HLAG mRNA的异常表达及意义［J］.南方医科大学学报，2010，30(7):1740－1742.

［9］GOLDMAN-WOHL DS，ARIEL I，GREENFIELD C，et al.Lack of human leukocyte antigen-G expression in extravillous trophoblasts is associated with pre-eclampsia［J］.Mol Hum Reprod，2000，6(1):88－95.